Hàm lượng protein mg/ml Hàm lượng protein mg/ml NaOH (M) Chủng BM 32 Chủng S51
24 giờ 36 giờ 48 giờ 24 giờ 36 giờ 48 giờ
0,05 0,3 0,8 1,6 0,2 0,5 0,7
0,1 1,8 2,1 2,4 1,3 2,4 2,5
0,2 2,6 2,8 3,5 2,1 2,8 3,3
0,5 2,1 3,4 3,42 2,4 2,7 3
Hàm lượng protein thu được khi xử lý nấm men nồng độ NaOH 0,05M trong 24 giờ không cao, đạt 0,3 mg/ml ở chủng nấm men BM 32 và 0,2 mg/ml ở chủng nấm men S51. Khi kéo dài thời gian xử lý kiềm nhiệt lên 24 và 36 giờ, lượng protein địnhlượng được cũng tăng nhưng không nhiều, chứng tỏ nồng độ kiềm 0,05M chưa thích hợp cho phá tế bào nấm men. Chúng tôi tiếp tục xử lý sinh khối 2 chủng nấm men với kiềm nồng độ 0,1; 0,2 và 0,5M và nhận thấy lượng protein tăng lên khi dùng kiềm 0,1M, ở 24 giờ, lượng protein định lượng được ở chủng BM 32 là
1,8 mg/ml, ở chủng S51 là 1,3 mg/ml. Tuy nhiên, khi kéo dài thời gian xử lý, lượng protein định lượng được tăng lên khoảng 30% ở chủng BM 32 và 45% ở chủng S51. Hàm lượng protein tạo thành lớn nhất khi xử lý kiềm nhiệt nồng độ 0,2M trong thời gian 36 giờ (chủng BM 32 lượng protein định lượng được là 3,5 mg/ml, chủng S51 lượng protein định lượng được là 3,3 mg/ml). Hàm lượng protein không tăng lên khi chúng tôi tăng nồng độ kiềm xử lý lên 0,5M .
Hình 3.6. Phá tế bào nấm men chủng BM 32 bằng NaOH 0,2M sau 36 giờ ủ 50ºC
Hình ảnh trên kính hiển vi điện tử SEM cho thấy hỗn dịch sinh khối nấm men sau xử lý bằng kiềm nhiệt ở thời gian 36 giờ còn khá nhiều tế bào nấm men ngun vẹn (vị trí B). NaOH 0,2 M có khả năng phá vỡ tế bào nấm men tuy nhiên mất nhiều thời gian nhưng hiệu suất phá tế bào không cao. Sử dụng kiềm nhiệt phá tế bào thu vách nấm men giàu β-glucan cần thời gian xử lý lâu, lượng kiềm sử dụng là khá lớn, chúng tôi tiến hành nghiên cứu phá tế bào nấm men thu vách giàu β-glucan bằng phương pháp enzyme với mục đích giảm thời gian và lượng kiềm xử lý.
3.3.2. Phá tế bào nấm men bằng enzyme
Thêm 5 ml đệm phosphat pH 6,0 vào các ống fancon chứa sẵn sinh khối nấm men đã chuẩn bị như trên, thả các ống fancon này vàobể cách thủy đang sôi trong 5 phút, sau 5 phút lấy ra, làm nguội về nhiệt độ phòng, bổ sung thêm 0,5 mg chitinase và protease hàm lượng theo bảng 4. Sau đó, ủ lắc trong tủ ấm ở 40oC, thời gian thay đổi 2; 4; 6; 8; 10 giờ. Hàm lượng protein của hỗn dịch sau xử lý enzyme được
Bảng3.7. Hàm lượng protein khi phá tế bào nấm men BM32 và S51 bằng enzyme STT S51 BM 32 STTHàm lượng protein (mg/ml)S51 BM 32 STT S51 BM 32 E1 4,33 5,2 E10 13,5 13,7 E19 12,3 12,9 E2 6,1 5,77 E11 8,8 9,6 E20 13,2 12,4 E3 6,9 7,8 E12 12,3 11,8 E21 5,6 6,3 E4 8,2 8,5 E13 13 14 E22 9,5 8,6 E5 9,6 8,9 E14 13,5 13,9 E23 13,4 14,1 E6 4,78 6 E15 11,6 12,7 E24 13,6 14,2 E7 8,5 9,2 E16 5,6 7,3 E25 14,1 13,8 E8 10,2 11,3 E17 10,2 9,8 E9 11,6 11,8 E18 13,2 12,7
Hàm lượng protein giải phóng khi sử dụng enzyme để phá tế bào nấm men thu vách giàu β-glucan lớn hơn khá nhiều so với sử dụng kiềm nhiệt. Ở mốc E1; E2; E3; E4 hàm lượng protease bổ sung là 1mg/ml, ủ thời gian thay đổi lần lượt là 2; 4; 6; 8 giờ hàm lượng protein của hỗn dịch sau định lượng là thấp nhất, lượng protein định lượng được cao nhất ở nồng độ protease bổ sung này khi ủ ở 8 giờ, đối với chủng BM 32 hàm lượng protein định lượng được là 8,2 mg/ml, đối với chủng S51 là 8,5 mg/ml. Khi tăng lượng protease lên, nhận thấy hàm lượng protein định lượng được cũng tăng theo. Tuy nhiên, lượng protein phụ thuộc vào thời gian xử lý enzyme. Các điểm định lượng được protein khá cao gồm: protease 2 mg/ml thời gian ủ ở 6 giờ (chủng BM 32 protein định lượng được 13 mg/ml, chủng S51 là 14 mg/ml), kéo dài thời gian lên 8 và 10 giờ, lượng protein định lượng được gần như khơng thay đổi thậm chí cịn giảm nhẹ ở chủng S51 (BM 32 là 13,2 mg/ml; chủng S51 là 12,7 mg/ml) chứng tỏ thời gian ủ enzyme kéo dài thêm cũng khơng giải phóng thêm nhiều protein do enzyme hoạt động dài có khả năng ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme. Tiến hành thử nghiệm tăng lượng enzyme bổ sung lên 2,5 và 3 mg/ml hỗn dịch. Lượng protein định lượng được ở mốc ủ 6; 8; và 10 giờ gần không thay đổi nhiều so với lượng protein sinh ra khi xử lý enzyme 2 mg/ml hỗn dịch trong thời
gian 6 đến 8 giờ. Để tiết kiệm chi phí cũng như thời gian phá tế bào thu β-glucan, chúng tôi lựa chọn sử dụng protease 2 mg/ml; chitinase 0,1 mg/ml ủ lắc ở 40oC trong 6 đến 8 giờ để tiến hành phá tế bào thu vách nấm men giàu β-glucan.
Hình 3.8. Phá tế bào nấm men BM 32 bằng protease 2 mg/ml ủ 6 giờ 40oC
Hình ảnh tế bào nấm men chủng BM 32 sau xử lý bằng chitinase và protease 2 mg/ml khi nhìn trên kính hiển vi điện tử SEM. Tế bào nấm men phần lớn đã bị phân cắt thành dạng mảnh hay dải (vị trí A), cịn rất ít tế bào nấm men ngun vẹn hình cầu hoặc ovan đặc trưng (vị trí B). Sử dụng enzyme giảm được thời gian xử lý và tăng được hiệu suất phá tế bào.
3.3.3. Thuvách nấm men giàu β-glucan
Tồn bộ lượng vách nấm men sử dụng thí nghiệm trên được chúng tơi trộn đều để nghiên cứu thu vách tế bào nấm men giàu β-glucan. Hỗn dịch sinh khối nấm men sau xử lý enzyme được ly tâm 8000v/p trong 10 phút, bỏ dịch nổi, thu lại phần lắng phía dưới, phần lắng này gồm vách nấm men giàu β-glucan và có thể có tạp chất như protein, ADN... do chưa được rửa sạch. Tiến hành rửa phần lắng bằng dung dịch đệm citrat pH 7.0; dung dịch NaOH 10 mM; dung dịch H3PO4 10mM và dung dịch CH3COOH10 mM [15, 23]1 lần,2 lần và 3 lần, mỗi lần 30 ml, ủ nhiệt độ phòng 1 giờ với các dung dịch sử dụng, ly tâm 8000 v/p trong 10 phút, bỏ phần dịch nổi, sau đó sấy khơ ở 80oC trong 4-5 giờ. Định lượng β-glucan thu được được mô tả ở bảng 3.7.Bảng số liệu cho thấy khi sử dụng dung dịch rửa là dung dịch CH3COOH
lượng vách có giảm đi, tuy nhiên hàm lượng β-glucan lại tăng lên. Khi sử dụng dịch rửa là đệm citrat và H3PO4 cho phần trăm β-glucan khá cao. Khi rửa bằng dung dịch H3PO4 lần 1, phần trăm β-glucan thu được ở trọng lượng khô là 39,1%, cao hơn khi sử dụng dung dịch rửa là nước (rửa 3 lần). Khi rửa bằng dung dịch H3PO4 lần 3, hàm lượng β-glucan thu được là 43,9%. Hàm lượng β-glucan thu được cao nhất khi sử dụng dung dịch rửa là đệm citrat pH 7,0, rửa 3 lần (44,6%), chúng tôi lựa chọn dung dịch đệm citrat pH 7,0 rửa 3 lần để thu vách nấm men giàu β-glucan. Nghiên cứu của Vesna Zechner-Krpan và cộng sự (2010) cũng sử dụng dung dịch đệm citrat để loại bỏ mannoprotein trong quá trình tinh sạch β-glucan từ vách tế bào nấm men [12].