Hình ảnh tế bào nấm men chủng BM 32 sau xử lý bằng chitinase và protease 2 mg/ml khi nhìn trên kính hiển vi điện tử SEM. Tế bào nấm men phần lớn đã bị phân cắt thành dạng mảnh hay dải (vị trí A), cịn rất ít tế bào nấm men ngun vẹn hình cầu hoặc ovan đặc trưng (vị trí B). Sử dụng enzyme giảm được thời gian xử lý và tăng được hiệu suất phá tế bào.
3.3.3. Thuvách nấm men giàu β-glucan
Tồn bộ lượng vách nấm men sử dụng thí nghiệm trên được chúng tơi trộn đều để nghiên cứu thu vách tế bào nấm men giàu β-glucan. Hỗn dịch sinh khối nấm men sau xử lý enzyme được ly tâm 8000v/p trong 10 phút, bỏ dịch nổi, thu lại phần lắng phía dưới, phần lắng này gồm vách nấm men giàu β-glucan và có thể có tạp chất như protein, ADN... do chưa được rửa sạch. Tiến hành rửa phần lắng bằng dung dịch đệm citrat pH 7.0; dung dịch NaOH 10 mM; dung dịch H3PO4 10mM và dung dịch CH3COOH10 mM [15, 23]1 lần,2 lần và 3 lần, mỗi lần 30 ml, ủ nhiệt độ phòng 1 giờ với các dung dịch sử dụng, ly tâm 8000 v/p trong 10 phút, bỏ phần dịch nổi, sau đó sấy khơ ở 80oC trong 4-5 giờ. Định lượng β-glucan thu được được mô tả ở bảng 3.7.Bảng số liệu cho thấy khi sử dụng dung dịch rửa là dung dịch CH3COOH
lượng vách có giảm đi, tuy nhiên hàm lượng β-glucan lại tăng lên. Khi sử dụng dịch rửa là đệm citrat và H3PO4 cho phần trăm β-glucan khá cao. Khi rửa bằng dung dịch H3PO4 lần 1, phần trăm β-glucan thu được ở trọng lượng khô là 39,1%, cao hơn khi sử dụng dung dịch rửa là nước (rửa 3 lần). Khi rửa bằng dung dịch H3PO4 lần 3, hàm lượng β-glucan thu được là 43,9%. Hàm lượng β-glucan thu được cao nhất khi sử dụng dung dịch rửa là đệm citrat pH 7,0, rửa 3 lần (44,6%), chúng tôi lựa chọn dung dịch đệm citrat pH 7,0 rửa 3 lần để thu vách nấm men giàu β-glucan. Nghiên cứu của Vesna Zechner-Krpan và cộng sự (2010) cũng sử dụng dung dịch đệm citrat để loại bỏ mannoprotein trong quá trình tinh sạch β-glucan từ vách tế bào nấm men [12].
Bảng 3.7. Lựa chọn dịch rửa thích hợp cho chiết vách nấm men
Loại dịch rửa Số lần rửa KL banđầu (g) KL saurửa (g) KL sau sấy(g) Β-glucan(%)
CH3COOH 1 lần 53,5 52,1 1,43 35,6 2 lần 50,7 48,5 0,95 37,3 3 lần 55,8 53,6 1,08 37,8 Đệm citrat pH 7.0 1 lần 60,1 56,7 1,23 41,2 2 lần 62,3 55,3 1,1 43,5 3 lần 66,9 57,7 0,94 44,6 NaOH 10 mM 1 lần 61,9 59,9 1,34 38,1 2 lần 50,7 44,1 0,91 40,2 3 lần 57,3 46,4 0,94 40,7 H3PO410 mM 1 lần 54,5 50,2 0,96 39,1 2 lần 62,4 55,5 0,95 41,7 3 lần 60,2 52,6 0,93 43,9
3.4. THU VÁCH NẤM MEN GIÀU β-GLUCAN QUY MƠ NỒI LÊN MEN
Ni cấy chủng nấm men BM 32 trong thiết bị lên men 30 lít có chứa 20 lít mơi trường MT4 và bổ sung SDS và EDTA hàm lượng lần lượt 80 và 60 pg/l.Nuôi cấy khuấy trong khoảng 36-40 giờ, thu dịch nuôi cấy, ly tâm ở 8000v/p trong 5 phút. Toàn bộ lượng sinh khối nấm men còn lại sử dụng để tách vách tế bào nấm men giàu β-glucan. Tiếp theo, chúng tơi chuyển tồn bộ dịch sinh khối sang bình tam giác 2 lít, tráng rửa bằng 600ml đệm phosphat pH 6.0.
Tổng thể tích thu được sau khi đã thêm đệm phosphat là 1,5 lít. Sau đó xử lý nhiệt trong bể cách thủy ở 100oC trong 10 phút để giúp phá vỡ một phần tế bào nấm men giúp enzyme có thể tác động vào vách tế bào dễ dàng hơn. Thêm 0,15 g enzyme chitinase và 3g protease vào bình tam giác chứa dịch sinh khối nấm men, ủ lắc ở40oC trong 6 giờ. Sau đó, ly tâm toàn bộ lượng dịch sinh khối đã xử lý enzyme ở 8000 v/p trong 10 phút, loại bỏ dịch nổi, tiếp tục rửa lại 3 lần bằng dung dịch H3PO4 10 mM và đệm citrat pH 7,0 để loại bỏ protein và axit amin cũng như các thành phần tạp khác. Sau đó, chuyển tồn bộ lượng dịch sinh khối sang khay inox, tiến hành sấy khô ở 80oC trong 4-5 giờ và định lượng β-glucan, kết quả được chúng tơi trình bày ở bảng 3.8
Bảng3.8. Hàm lượng β-glucan thu được sau 3 lần nuôi cấy trong thiết bị lên men 30 lít
STT Sinh khốiướt (g) β-glucan trọnglượng khô (%) vách nấm menKhối lượng (g)
β-glucan sau thu vách (%)
Lần 1 630 16,7 15,5 44,5
Lần 2 606 15,4 14,8 43,1
Lần 3 652 16,2 16,1 46,2
Sau 3 lần nuôi cấy độc lập trên thiết bị lên men 30 lit, tiến hành phá tế bào thu vách tế bào giàu β-glucan, hàm lượng vách tế bào trung bình thu được là 15,5g β- glucan chiếm 44,6%, điều này phù hợp với nghiên cứu của Yiannikouris và cộng sự
(2004) hàm lượng β-glucan trong nghiên cứu này là 42%[22]. Tuy nhiên, nghiên cứu của Francois và cộng sự (2003) đã chỉ ra rằng tỉ lệ các hợp chất cấu thành lên vách tế bào nấm men nhưβ-glucan, manoprotein và chitin phụ thuộc vào chủng nấm men, điều kiện nuôi cấy và thời gian. Hàm lượng β-glucan định lượng được ở nghiên cứu của Francois là xấp xỉ 27% [1],hàm lượng β-glucan trong nghiên cứu của Suphantharika và cộng sự là xấp xỉ 34%, đặc biệt hàm lượng β-glucan tính theo trọng lượng khô tế bào đạt đến 72,02% trong nghiên cứu của Minh Tâm và cộng sự. THẢO LUẬN
Beta-glucan là hợp chất có khả năng tương tác với hệ miễn dịch và điều chỉnh một số khía cạnh nhất định của hệ thống miễn dịch của vật chủ. Việc sử dụng β- glucan cho phép vật chủ tự bảo vệ mình chống lại sự xâm nhập của vi sinh vật một cách hiệu quả mà không liên quan đến việc sử dụng thuốc kháng sinh đặc hiệu để kháng vi sinh vật, gần đây đang trở thành một mối quan tâm lớn do ngày càng xuất hiện nhiều chủng vi sinh vật kháng thuốc. Đặc tính làm lành vết thương của nấm đã được biết đến hàng ngàn năm nay, với báo cáo đầu tiên về khả năng y học của chúng được đánh dấu khoảng 3000 năm trước cơng ngun mặc dù đặc tính này có ở một số thành phần khác nhau của tế bào nấm men, β-glucan lôi kéo sự chú ý hơn cả. Mối quan tâm về polymer này bắt đầu từ những năm 1990 khi lần đầu tiên phát hiện nấm có khả năng tăng cường hệ miễn dịch cho tế bào vật chủ. Điều này dẫn đến việc sản xuất thành tế bào không tan gọi là zymosan. Những nghiên cứu về sau cho thấy tiêm trực tiếp zymosan vào tĩnh mạch có thể hoạt hố sự miễn dịch, kích thích đáp ứng bảo vệ cơ thể vật chủ. Mặc dù zymosan có nhiều thành phần khác nhau (glucan, mannan, chitin, protein, lipit) β-glucan được định danh như là một thành phần có hoạt tính sinh học. Vì vậy zymosan được sử dụng trong nhiều nghiên cứu chức năng miễn dịch cả invivo và invitro [20]. Trên 50 năm qua, rất nhiều nhà khoa học và viện nghiên cứu trên thế giới đã góp phần to lớn vào việc định loại, tách triết, làm sạch và định tính các thành phần khác nhau của1,3 β- glucan. Những nghiên cứu chỉ ra rằng hợp chất này kích thích các tế bào khác nhau trong hệ miễn dịch và điều hòa miễn dịch rất lớn, bao gồm kháng khối u, kháng nhiễm và làm lành
vết thương. Trong 10 năm qua các nhà khoa học và các bác sỹ trong nhiều lĩnh vực đã chú ý đến việc sử dụng 1,3 β-glucan để giải quyết rất nhiều vấn đề, ví dụ bệnh nhân bị dị ứng với thuốc, nhiễm nấm và ung thư. Tất cả những thách thức này thường rất khó giải quyết và các bệnh này đều có đặc điểm trung là đều đáp ứng miễn dịch khơng đầy đủ. Vì vậy, bổ sung β-glucan có thể tăng khả năng đáp ứng miễn dịch của cơ thể bệnh nhân [28]. Với những ứng dụng to lớn của β-glucan trong các lĩnh vực y học, thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm...vấn đề nghiên cứu sản xuất β-glucan sử dụng cho con người cần được quan tâm. Chúng tôi lựa chọn phân lập nấm men dựa trên những sản phẩm lên men truyền thống với mong muốn lựa chọn được các chủng nấm men hoang dại có hàm lượng β-glucan trong vách tế nào cao. Hai chủng nghiên cứu được phân loại dựa vào hình thái và phân tích trình tự ADNr vùng ITS, chủng BM 32 được xác định thuộc lồi Kluyveromyces lactis và chủng S51thuộc Saccharomyces cerevisiae. Trong đó, chủng nấm men Saccharomyces cerevisiaelà chủng khá phổ biến được sử dụng rộng rãi trong các
ngành công nghiệp như lên men bia rượu. Ngoài ra, rất nhiều các nhà khoa học trong nước và quốc tế cũng sử dụng chủng nấm men này để nghiên cứu tách chiết β- glucan, nghiên cứu của Hasan T. và cộng sự (2008) đã nghiên cứu tách chiết β- glucan từ nấm men bánh mì sử dụng kiềm nhiệt [12]. Hay nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Sơn cùng đồng nghiệp tại trường đại học Bách Khoa Hà Nội (2013) nghiên cứu tách chiết β-glucan từ bã men bia. Tuy nhiên, chưa có một nghiên cứu nào tách chiết β-glucan từ chủng Kluyveromyces lactis. Trong khuôn khổ luận văn này,
chúng tôi nghiên cứu tách chiết β-glucan từ chủng BM 32: Kluyveromyces lactisđể
so sánh với chủng S51: Saccharomyces cerevisiaelà chủng được sử dụng phổ biến.
Chúng tơi đã lựa chọn được mơi trường thích hợp cho ni cấy thu sinh khối nấm men. 2 chất ức chế là SDS và EDTA được lựa chọn để kích thích sinh tổng hợp β- glucan trong vách tế bào. SDS và EDTA là chất ức chế đối với vi sinh vật ở nồng độ nhất định, tuy nhiên với hàm lượng rất nhỏ, vi sinh vật sẽ có cơ chế để thích nghi với điều kiện bất lợi này. Cụ thể, nấm men sẽ đáp ứng lại điều kiện bất lợi bằng cách điều hịa tăng tổng hợp β-glucan có trong vách tế bào để đáp ứng lại với điều
kiện bất lợi [30]. Chúng tôi đã lựa chọn được hàm lượng SDS và EDTA cho 2 chủng nấm men nghiên cứu để tăng hàm lượng β-glucan trong vách từ xấp xỉ 10% lên xấp xỉ 15% so với trọng lượng khô tế bào (tăng gần 50% so với ban đầu), điều này tương đối phù hợp với kết quả nghiên cứu của Narmon và cộng sự (2013) đã kết luận các điều kiện ni cấy có thể ảnh hưởng đến thành phần cấu thành lên vách tế bào nấm men, ông cũng sử dụng bổ sung SDS và EDTA vào mơi trường ni cấy giúp kích thích tăng lượng β-glucan trong vách tế bào lên 40% so với ban đầu [30].
Có nhiều cách để phá tế bào nấm men như: phương pháp nghiền bằng hạt thủy tinh, sonic, kiềm nhiệt, enzyme. Nghiên cứu của Hasan T. và cộng sự (2013) phá tế bào nấm men bằng kiềm nhiệt ở 60oC trong 72 giờ [12]. Nghiên cứu của Jonh Conway và cộng sự (2001) sử dụng phá tế bào nấm men sử dụng protease và glucanase ở pH 5,0-6,0 đã mang lại hiệu quả phá tế bào nấm men cao nhất so với các nghiên cứu của ông khi sử dụng phá tế bào nấm men bằng kiềm nhiệt [8]. Điều này hoàn toàn hợp lý khi chúng tôi sử dụng phương pháp phá tế bào bằng nấm men bằng enzyme protease và chitinase. Sử dụng phương pháp phá tế bào bằng enzyme là phương pháp hiệu quả, khơng sử dụng đến các hóa chất nên an toàn khi sử dụng và đặc biệt hạn chế tối đa lượng chất thải ra môi trường khi tiến hành sản xuất trên qui mơ cơng nghiệp.
Với mục đích tách chiết được vách tế bào nấm men có hàm lượng β-glucan cao, chúng tôi tiếp tục sử dụng đệm citrat và axit H3PO4 để rửa vách tế bào nấm men sau phá với mong muốn loại bỏ các tạp chất như ADN, protein.... Điều này phù hợp với nghiên cứu của Karpa (2010) hay Javen và cộng sự (2013) khi sử dụng dung dịch rửa vách tế bào sau phá vách là H3PO4 và đệm citrat để loại bỏ mannoprotein. Bên cạnh đó, nghiên cứu của Atunja và cộng sự (2012) sử dụng dung dịch rửa là axit acetic [1] cũng thu được hiệu quả chiết vách tế bào nấm men giàu β- glucan với hàm lượng khá cao.
Như vậy, sử dụng phương pháp phân lập, tối ưu hóa mơi trường kích thích sinh tổng hợp β-glucan, chúng tơi đã phân lập được 2 chủng nấm men từ tự nhiên có hàm lượng β-glucan trong vách tế bào cao, đã xây dựng được phương pháp thu hồi
vách tế bào giàu β-glucan từ nấm men, nghiên cứu thu hồi trên qui mô nồi lên men có khả năng ứng dụng sản xuất trên qui mô công nghiệp, ứng dụng sử dụng cho các sản phẩm ngăn ngừa và điều trị ung thư. Liệu rằng cấu trúc β-glucan trong vách tế bào 2 chủng nấm men BM 32 và S51 có gì giống hay khác nhau, hay tác động của β-glucan thu hồi từ 2 chủng nấm men này đến con người như thế nào? Điều này rất cần được tiếp tục nghiên cứu và bàn luận để khẳng định ở các nghiên cứu tiếp theo.
KẾT LUẬN
1. Đã phân lập được 112 chủng nấm men, trong đó có 64 chủng nấm men có khả năng phát triển tốt, lựa chọn được 2 chủng nấm men BM 32 và S51 có thành phần β-glucan trong tế bào cao.
2. Hai chủng nghiên cứu được phân loại dựa vào hình thái và phân tích trình tự ADNr vùng ITS, chủngBM 32 được xác định thuộc loàiKluyveromyces lactis và chủngS51thuộcSaccharomyces cerevisiae.
3. Lựa chọn được các điều kiện ni thích hợp cho thu nấm men giàu β-glucan trên mơi trường MT4có bổ sung SDS- 80pg/l; EDTA- 60 pg/l đối với chủng BM 32 và SDS- 80pg/l; EDTA- 30 pg/l đối với chủng S51, nuôi cấy ở 30oC trong thời gian 36-40 giờ.
4. Hiệu quả phá vách nấm men cao khi sử dụng enzyme protease 2 mg/ml và chitinase-0,1 mg/ml, ủ 40oC, thời gian 6- 8 giờ. Hiệu suất thu hồi vách nấm men giàu β-glucan tốt khi sử dụng dung dịch rửa là đệm citrat pH 7,0.
5. Nghiên cứu thu hồi vách nấm men trên quy mô thiết bị lên men 30 lít, khối lượng vách nấm men thu được trung bình là 15,5 g với hàm lượng β-glucan là 44,6%.
KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục nghiên cứu cấu trúc của β-glucan trong vách tế bào nấm men giàu β- glucan
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Atunr, B., Frand. Gb, and Saurir. Ba (2009), Chemistry, Biochemistry, and Biology of (1-3)-β-Glucans and Related Polysaccharides, The Netherlands:
Academic Press, Amsterdam.
2. Aguilar-Uscanga, B. and J.M. Francois (2003), “A study of the yeast cell wall composition and structure in response to growth conditions and mode of cultivation”,Letters in applied microbiology, 37(3), pp. 268-274.
3. Aleem, E. (2012), “β -Glucans and their Applications in Cancer Therapy: Focus on human studies”,Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry, 13(5).
4. Arvindekar, A.U. and N.B. Patil (2002), “Glycogen--a covalently linked component of the cell wall in Saccharomyces cerevisiae”, Yeast, 19(2), pp.
131-139.
5. Babincova, M., Z. Bacova, E. Machova, and G. Kogan (2002), “Antioxidant properties of carboxymethyl glucan: comparative analysis”, Journal of medicinal food, 5(2), pp. 79-83.
6. C., S.P., A.M.R. M., and M.G. R. (2014), “Β-glucans: what types exist and what are their health benefits?”,Revista chilena de nutrición, 41(3), pp. 439-
446.
7. Chan, G.C., W.K. Chan, and D.M. Sze (2009), “The effects of beta-glucan on human immune and cancer cells”, Journal of hematology & oncology, 2,
pp. 25.
8. Conway, J., H. Gaudreau, and C.P. Champagne (2001), “The effect of the addition of proteases and glucanases during yeast autolysis on the production and properties of yeast extracts”, Canadian journal of microbiology, 47(1),
pp. 18-24.
9. Czop, J.K. and K.F. Austen (1985), “A beta-glucan inhibitable receptor on human monocytes: its identity with the phagocytic receptor for particulate activators of the alternative complement pathway”, Journal of immunology,
10. Fisher, M. and L.X. Yang (2002), “Anticancer effects and mechanisms of polysaccharide-K (PSK): implications of cancer immunotherapy”,
Anticancer research, 22(3), pp. 1737-1754.
11. Gilchrist, J.E., J.E. Campbell, C.B. Donnelly, J.T. Peeler, and J.M. Delaney (1973), “Spiral plate method for bacterial determination”, Applied microbiology, 25(2), pp. 244-252.
12. Hasan Tangüler, H.E. (2009), “The Effect of Different Temperatures on Autolysis of Baker’s Yeast for the Production of Yeast Extract”, Turkish Journal of Agriculture and Forestry, 33(2009), pp. 149-154.
13. Hunter, K.W., Jr., R.A. Gault, and M.D. Berner (2002), “Preparation of microparticulate β-glucan fromSaccharomyces cerevisiae for use in immune