Chương 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.4.1. Kích thích tăng tổng hợp β-glucan: Bổ sung thêm EDTA
Lấy 1 khuẩn lạc thuần khiết vào bình tam giác chứa 50 ml mơi trường nhân giống MT1, nuôi lắc 20-24 giờ, dịch huyền phù thu được là dịch giống cấp 1. Cấy 5% giống cấp 1 vào mơi trường ni cấy thích hợp đã lựa chọn bổ sung thêm, EDTA (0; 30; 60; 80; 100; 120; 150 pg/l) [20]. EDTA được chuẩn bị dưới dạng dung dịch gốc, nồng độ 100µg/ml. Dung dịch gốc này được sử dụng để bổ sung vào môi trường ni cấy thích hợp đã lựa chọn. Lượng dung dịch gốc EDTA bổ sung lần lượt 0; 30; 60; 80; 100; 120; 150µl trong 100ml mơi trường tương ứng với hàm lượng EDTA 0; 30; 60; 80; 100; 120; 150 pg/l. Ni lắc ở 150 vịng/ phút, 30oC trong 30-36 giờ, ly tâm ở 8000v/p trong 5 phút, thu sinh khối, sấy khô ở 80oC trong 2-4 giờ, tiến hành định lượng β-glucan sử dụng bộ kit megazyme để lựa chọn hàm lượng EDTA bổ sung thích hợp cho q trình tổng hợp β-glucan. Lặp lại 3 lần cho mỗi thí nghiệm.
2.2.4.2. Kích thích tăng tổng hợp β-glucan: Bổ sung thêm SDS
Cấy 5% giống cấp 1 vào mơi trường ni cấy thích hợp đã lựa chọn bổ sung thêmSDS (0; 30; 60; 80; 100; 120; 150 pg/l) [20], SDS được chuẩn bị dưới dạng
dung dịch gốc, nồng độ 100µg/ml. Dung dịch gốc này được sử dụng để bổ sung vào môi trường nuôi cấy. Lượng dung dịch gốc SDS bổ sung lần lượt 0; 30; 60; 80; 100; 120; 150µl trong 100ml mơi trường tương ứng với hàm lượng SDS 0; 30; 60; 80; 100; 120; 150 pg/l lắc ở 150 vòng/ phút, 30oC trong 30-36 giờ , ly tâm ở 8000v/p trong 5 phút, thu sinh khối, sấy khô ở 80oC trong 2-4 giờ, tiến hành định lượng β- glucan sử dụng bộ kit megazyme để lựa chọn hàm lượng SDS bổ sung thích hợp cho q trình tổng hợp β-glucan. Lặp lại 3 lần cho mỗi thí nghiệm.
2.2.4.3. Kích thích tăng tổng hợp β-glucan: Bổ sung hỗn hợp EDTA và SDS [20].
Hàm lượng SDS và EDTA bổ sung vào mơi trường được trình bày như bảng dưới đây:
Bảng 2.1.Hàm lượng hỗn hợp SDS và EDTA bổ sung vào môi trường
Hàm lượng EDTA (pg/l) Hàm lượng SDS (pg/l) 30 60 80 100 120 150 30 H1 H2 H3 H4 H5 H6 60 H7 H8 H9 H10 H11 H12 80 H13 H14 H15 H16 H17 H18 100 H19 H20 H21 H22 H23 H24 120 H25 H26 H27 H28 H29 H30 150 H31 H32 H33 H34 H35 H36
Cấy 5% giống cấp 1 vào môi trường ni cấy thích hợp đã lựa chọn bổ sung thêm, SDSvà EDTA theo, ni lắc ở 150 vịng/ phút, 30oC trong 30-36 giờ , ly tâm ở 8000v/p trong 5 phút, thu sinh khối, sấy khô ở 80oC trong 4-5 giờ, tiến hành định lượng β-glucan sử dụng bộ kit megazyme để lựa chọn hàm lượng SDS và EDTA bổ sung thích hợp cho q trình tổng hợp β-glucan. Lặp lại ít nhất 3 lần cho mỗi thí nghiệm.
2.2.4.4. Lựa chọn thời gian ni cấy thu β-glucan
Sau khi đã lựa chọn được hàm lượng chất ức chế tiến hành lựa chọn thời gian ni cấy thích hợp để thu sinh khối nấm men giàu β-glucan. Cấy 5% giống cấy vào bình tam giác chứa 100ml mơi trường thích hợp mục (2.2.4). Ni cấy lắc ở nhiệt độ đã lựa chọn (mục 2.2.3.3) trong khoảng thời gian 24; 30; 36; 40; 48; 72 giờ. Sau đó, thu dịch ni cấy, ly tâm thu sinh khối, sấy khô và định lượng β-glucan để lựa chọn thời gian thích hợp cho q trình ni cấy thu sinh khối nấm men. Lặp lại 3 lần cho mỗi thí nghiệm.
2.2.5. Phương pháp thu hồi vách tế bào nấm men
Chúng tôi tiến hành cấy 5% dịch giống cấp 1 vào bình tam giác 2 lít chứa 1,5 lít mơi trường ni cấy có bổ sung chất ức chế với hàm lượng đã lựa chọn, lắc 150 vòng/phút trong 30 giờ ở 30oC. Hút 50 ml nhũ dịch nuôi cấy vào ống Falcon 50, ly tâm 6000v/p trong 5 phút. Loại bỏ phần dịch nổi, phần sinh khối nấm men được sử dụng để nghiên cứu thu hồi vách tế bào nấm men giàu β-glucan. Lặp lại 3 lần cho mỗi thí nghiệm.
2.2.5.1. Phá tế bào nấm men bằng kiềm nhiệt[12, 22, 45]
Thêm 10ml NaOH nồng độ thay đổi vào ống fancon chứa sinh khối nấm men đã chuẩn bị ở trên, lắc đều ở 60oC, nồng độ NaOH sử dụng thay đổi lần lượt là0,05; 0,1; 0,2; 0,5M với thời gian 24; 36; 48 giờ, sau đó ly tâm 8000v/p trong 10 phút để đánh giá khả năng phá vách tế bào nấm men. Lặp lại thí nghiệm 3 lần.
2.2.5.2. Phá tế bào nấm men bằng phương pháp enzyme [8, 10]
Thêm 5ml dung dịch đệm phosphat pH 6,0 vào ống fancon 50 chứa sinh khối nấm men đã ly tâm, lắc đều bằng máy vontex. Dịch sinh khối nấm men trong đệm được sử dụng để nghiên cứu phương pháp thu hồi vách tế bào nấm men giàu β- glucan. Các ống Falcon chứa dịch sinh khối được chúng tôi tiến hành xử lý nhiệt ở 100oC trong 5 phút sau đó tiến hành phá tế bào nấm men bằng phương pháp enzyme. Dịch phá tế bào được ly tâm ở 6000v/p trong 10 phút, loại bỏ dịch nổi, phần tủa dưới đáy là vách tế bào nấm men. Enzyme chúng tôi lựa chọn để tiến hành phá tế
bào nấm men gồm protease (Sigma) và chitinase (Megazyme) [8, 49] trong đó hàm lượng chitinase được thêm vào 0,1 mg/ml nhũ dịch.
Bảng 2.2.Nồng độ protease và thời gian xử lý enzyme để phá tế bào nấm men
Thời gian xử lý enzyme (giờ) Hàm lượng protease (mg/ml) 1 1,5 2,0 2,5 3,0 2 E1 E2 E3 E4 E5 4 E6 E7 E8 E9 E10
6 E11 E12 E13 E14 E15
8 E16 E17 E18 E19 E20
10 E21 E22 E23 E24 E25
Hàm lượng protease thêm vào được thay đổi lần lượt từ 1; 1,5; 2; 2,5; 3 mg/ml nhũ dịch sinh khối trong đệm phosphat pH 6,0. Ủ lắc ở 40oC, thời gian thay đổi từ 2 đến 10 giờ [8, 10] để lựa chọn thời gian và hàm lượng protease thích hợp. Định lượng protein để đánh giá khả năng phá vách tế bào nấm men.
2.2.5.3. Chiết vách tế bào nấm men giàu β-glucan
Hỗn dịch sinh khối nấm men sau xử lý phá tế bào được ly tâm 8000 v/p trong 10 phút, bỏ dịch nổi, thu lại phần lắng phía dưới, phần lắng này gồm vách nấm men giàu β-glucan và có thể có tạp chất như protein, ADN... do chưa được rửa sạch. Rửa phần lắng bằng dung dịch đệm citrat pH 7.0; dung dịch NaOH 10 mM; dung dịch H3PO4 10mM và dung dịch CH3COOH 10 mM [15, 23] 1 lần, 2 lần và 3 lần, ủ nhiệt độ phòng 1 giờ với các dung dịch sử dụng, sau đó ly tâm 8000 v/p trong 10 phút, bỏ phần dịch nổi, phần lắng được sấy khô ở 80oC trong 4-5 giờ, tiến hành định lượng β-glucan để đánh giá khả năng chiết của các dung dịch
2.2.6. Thử nghiệm trên thiết bị nuôi cấy 30 lit
Nuôi cấy thử nghiệm chủng BM 32 trên thiết bị ni cấy có chứa 20 lít mơi trường thích hợp cho thu sinh khối nấm men giàu β-glucan, cấy 5% giống cấy. Sau thời gian nuôi cấy, tiến hành thu sinh khối nấm men, ly tâm ở 8000v/p trong 10
phút. Phá tế bào nấm men và chiết vách nấm men giàu β-glucan (mục 2.2.5). Toàn bộ lượng vách sau chiết được sấy khô cân khối lượng và định lượng β-glucan, lặp lại thí nghiệm 3 lần.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN VÀ PHÂN LOẠI CHỦNG NẤM MEN GIÀU Β-GLUCAN CÓ NGUỒN GỐC TỰ NHIÊN GLUCAN CÓ NGUỒN GỐC TỰ NHIÊN
3.1.1. Phân lập và tuyển chọn nấm men
Mục đích của đề tài là nghiên cứu phương pháp thu hồi β-glucan từ tế bào nấm men phân lập từ tự nhiên. 12 mẫu phân lập gồm mẫu bánh men, hoa quả chín, men rượu được thu thập từ các vùng quanh khu vực Hà Nội. Các mẫu bánh men, hoa quả chín sau khi được thu thập sẽ được bảo quản và tiến hành xử lý, phân lập theo phương pháp pha lỗng trên đĩa thạch Hansen có bổ sung cloramphenicol 50mg/l, ủ 48 giờ ở 25-300C. Quan sát thấy xuất hiện các khuẩn lạc khác nhau, có cả nấm mốc và nấm men.Chúng tôi chọn khuẩn lạc nghi ngờ là nấm men đem nuôi cấy thuần khiết và bảo quản để tiếp tục nghiên cứu, tạm gọi mỗi khuẩn lạc riêng rẽ đó là chủng và phân lập được 112 chủng nấm men.Các chủng phân lập được nuôi cấy trong 100 ml môi trường Hansen lỏng ở 30oC, lắc 150 vòng/ phút trong 30 giờ. Sau 30 giờ,ly tâm ở 6000 v/p trong 10 phút, bỏ dịch nổi, phần lắng phía dưới là sinh khối nấm men, thu phần lắng sinh khối và sấy khô trong 2-4 giờ ở 80oC. Đánh giá sơ bộ khả năng sinh trưởng của nấm men bằng phương pháp cân sinh khốiđểlựa chọn các chủng nấm men phát triển tốt, loại bỏ các chủng nấm men phát triển kém.
Bảng 3.1. Nguồn gốc và số chủng nấm men phân lập được
STT Nguồn phân lập Số chủng phânlập được Khả năng pháttriển tốt
1 Bánh men Hoài Đức 18 13
2 Bánh men Quốc Oai 17 15
3 Bánh men Phú xuyên 11 7
4 Bánh men Phùng 10 3
5 Bánh men Thanh Oai 14 6
6 Men rượu Nhổn 3 2
7 Men rượu Sơn Đồng 12 5
8 Men bánh mỳ 10 4
STT Nguồn phân lập Số chủng phânlập được Khả năng pháttriển tốt
10 Đu đủ chín 4 2
11 Nho chín 5 2
12 Xồi chín 3 2
Khối lượng sinh khối khơ trung bình của 112 chủng nấm men nghiên cứu khi tiến hành lọc, sấy khô 50 ml dịch nuôi cấy là 0,68g. Các chủng nấm men có khối lượng sinh khối khơ ≥ 0,68g được coi là chủng nấm men phát triển tốt, các chủng nấm men có khối lượng sinh khối khơ <0,68g được coi là chủng nấm men phát triển kém. Lựa chọn được 64 chủng nấm men phát triển tốt để và tiến hành định lượng β- glucan. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, kết quả được lấy trung bình ở 3 lần thí nghiệm và được trình bày dưới bảng 3.2.
Bảng 3.2. Hàm lượng β-glucan ở 64 chủng nấm men phân lập
STT Chủng %β.G STT Chủng %β.G STT Chủng %β.G 1 HD1 6,32 23 BM 17 6,26 45 S43 5,37 2 HD2 4,16 24 BM 18 7,41 46 S48 7,72 3 HD5 4,33 25 BM 21 6,34 47 S49 6,86 4 HD9 8,69 26 BM 32 10,1 48 S50 7,91 5 HD10 7,93 27 BM 33 5,67 49 HD2.3 7,89 6 HD23 8,44 28 BM 37 7,89 50 HD2.42 5,92 7 HD25 5,19 29 BM 38 5,38 51 HD2.49 8,19 8 HD27 8,21 30 Q1.1 8,19 52 HD3.8 6,48 9 HD30 7,43 31 Q1.2 6,67 53 HD3.12 7,18 10 HD31 8,43 32 Q1.5 7,58 54 HD4.11 7,8 11 HD37 7,66 33 Q2.2 5,67 55 HD4.13 5,55 12 HD42 7,23 34 Q2.3 7,89 56 HD4.15 5,69 13 HD47 5,64 35 Q3.4 5,38 57 HD4.16 8,08 14 HD55 7,23 36 Q3.6 8,19 58 S51 9,88 15 QA2.3 5,77 37 Q3.7 5,23 59 S60 6,21
STT Chủng %β.G STT Chủng %β.G STT Chủng %β.G 16 QA2.8 8,12 38 S6 5,87 60 S62 6,75 17 QA2.23 7,45 39 S12 7,17 61 D4 5,89 18 QA3.2 7,46 40 S20 7,37 62 D5 7,33 19 QA3.3 7,27 41 S26 8,58 63 N4 8,23 20 QA3.5 7,68 42 S34 6,43 64 N6 8,63 21 QA3.9 8,42 43 S41 8,27 22 BM 13 8,28 44 S42 5,2
Bảng số liệu trên cho thấy có 15 chủng nấm men có hàm lượng β-glucan trong vách tế bào nằm trong khoảng từ 4-6%, 31 chủng nấm men có hàm lượng β-glucan trong vách tế bào nằm trong khoảng 6-8% và 18 chủng nấm men có hàm lượng β- glucan trong vách tế bào nằm trong khoảng ≥8%. Trong đó, chủng nấm men S51 và chủng nấm men BM 32 có hàm lượng β-glucan cao nhất trong tổng số 64 chủng nấm men lựa chọn (β-glucan S51: 10,1%; BM32: 9,88%). Chủng nấm men S51 phân lập từ mẫu xồi chín thu thập tại Hoài Đức-Hà Nội và BM32 phân lập từ mẫu bánh men rượu thu thập tại Quốc Oai- Hà Nội. 2 chủng đều có khả năng phát triển tốt (hình 3.1). Lựa chọn 2 chủng này để tiếp tục nghiên cứu lựa chọn mơi trường ni cấy thu sinh khối nấm men.Hình 3.1 là hình ảnh ni cấy lắc chủng nấm men BM32 và S51 trên môi trường lỏng Hansen ở nhiệt độ 30oC với thời gian 30 giờ
3.1.2. Đặc điểm hình thái
Đặc điểm hình thái chủng S51
+ Khuẩn lạc: Sau 4 ngày ni cấy trên đĩa thạch mơi trường Hansen, khuẩn lạc có màu trắng, hình trịn, lồi, bề mặt nhẵn, bóng, mép trơn, kích thước 3.5 - 6.0 mm, khơng tiết sắc tố vào môi trường
+ Sau 2 ngày nuôi tĩnh trên môi trường Hansen dịch thể tế bào có dạng hình cầu, hình trứng, nảy chồi 1- 2 phía, kích thước (2.5-3.5) x (3.0-4.0) µm, bar = 5 µm.
Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng S51
Đặc điểm hình thái chủng BM 32
+ Sau 4 ngày nuôi cấy trên đĩa thạch mơi trường Hansen, khuẩn lạc có màu trắng, hình trịn, lồi, bề mặt nhẵn, bóng mép trơn đều hoặc có gờ, kích thước 0.5 – 1.5 mm, khơng tiết sắc tố vào môi trường.
+ Tế bào: Sau 2 ngày nuôi tĩnh trên mơi trường Hansen dịch thể tế bào có dạng hình trứng, hình elip, nảy chồi 1 phía, kích thước (4.0-6.0) x (4.5-6.5) µm, bar = 5 µm.
Hình 3.2. Hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng BM 32
3.1.3. Định danh và xây dựng cây phát sinh chủng loại
Chủng nấm men S51 và BM 32 được nuôi cấy trên môi trường MT1 lỏng, sau 48 giờ, ly tâm lấy phần sinh khối. DNA genome của 2 chủng nấm men nghiên cứu được tách chiết và dùng làm khuôn để khuếch đại đoạn gen ITS bằng phản ứng PCR, sử dụng cặp mồi ITS1 và ITS4. Sản phẩm sau PCR được xác định có kích thước khoảng 700 bp. Chương trình Blast được sử dụng để so sánh độ tương đồng với trình tự của các lồi có quan hệ họ hàng gần. Cây phát sinh chủng loại của chủng nghiên cứu với 16 loài thuộc chi Saccaromyces và Kluyveromyces đã được xây dựng dựa vào trình tự đoạn gen ITS, Zygosaccharomyces rouxiiđược sử dụng
Hình 3.2. Cây phát sinh chủng loại của 2 chủng nấm men nghiên cứu
Trình tự ADNr ITS của chủngBM 32 tương đồng 99,85% với trình tự ADNr ITS của Kluyveromyces lactis_KY103776(679/680 bp). Trình tự ADNr ITS của
chủngS51tương đồng 99,56% với trình tự ADNr ITS của Saccharomyces cerevisiae_AY046146(677/680 bp).
Từ các kết quả hình thái và phân tích trình tự ADNr ITS chủng BM 32 thuộc loài
Kluyveromyces lactis và chủng S51 thuộc Saccharomyces cerevisiae. Chủng
S.cerevisiae là chủng nấm men phổ biến sử dụng trong các nghiên cứu vềphân lập và thu hồi vách tế bào giàu nguồn β-glucan. Nguồn β-glucan chiết xuất từ chủng này đã được thương mại hóa trong nhiều thuốc thành phẩm sử dụng cho con người. Do đó, trong khn khổ luận văn này chúng tôi vẫn tiếp tục lựa chọn chủng nấm men này với hi vọng có thể nghiên cứu cải thiện hiệu suất thu hổi β-glucan. Đối với chủng Kluyveromyces lactis, đây là chủng còn khá mới mẻ trong các nguồn nấm
được sử dụng để chiết xuất, chúng tôi lựa chọn phân lập và nghiên cứu thử nghiệm tách chiết thu hồi β-glucan để so sánh với các chủng giống đã được sử dụng trước đây.
3.2. LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY THU SINH KHỐI NẤM MEN GIÀUΒ-GLUCAN Β-GLUCAN
3.2.1. Lựa chọn môi trường nuôi cấy nấm men
Sau khi lựa chọn được chủng nấm men có hàm lượng β-glucan cao, chúng tơi tiếp tục nghiên cứu lựa chọn mơi trường thích hợp để thu sinh khối nấm men. Các môi trường chúng tôi lựa chọn được ký hiệu: MT1, MT2, MT3, MT4, MT5. Lấy 1 vòng que cấymỗi chủng nấm men trong ống thạch nghiêng đưa vào bình tam giác 250 ml chứa 50ml mơi trường MT1 dịch thể, nuôi lắc ở 30oC trong 24 giờ. Nhũ dịch sau nuôi cấy được gọi là dịch giống cấy. Cấy vào bình tam giác chứa các mơi trường khác nhau 5% giống cấy, nuôi lắc ở 30oC. Sau 48 giờ, định lượng mật độ tế bào nấm men bằng phương pháp đổ đĩa thạch. Kết quả trung bình sau 3 lần thí nghiệm độc lập được trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Lựa chọn môi trường nuôi cấy cho 2 chủng nấm men nghiên cứu
Tên chủng
Mật độ nấm men (Ax107CFU/ml)
MT1 MT2 MT3 MT4 MT5
BM32 2,3 4,3 8,9 45 12
S51 3,4 2,1 10,6 56,9 12,5
Từ bảng trên cho thấy mật độ 2 chủng nấm men BM32 và S51 sau nuôi cấy ở các môi trường khác nhau là khác nhau. Khi nuôi cấy ở môi trường MT1 mật độ cả