Hàm lượng EDTA (pg/l) Hàm lượng SDS (pg/l) 30 60 80 100 120 150 30 H1 H2 H3 H4 H5 H6 60 H7 H8 H9 H10 H11 H12 80 H13 H14 H15 H16 H17 H18 100 H19 H20 H21 H22 H23 H24 120 H25 H26 H27 H28 H29 H30 150 H31 H32 H33 H34 H35 H36
Cấy 5% giống cấp 1 vào mơi trường ni cấy thích hợp đã lựa chọn bổ sung thêm, SDSvà EDTA theo, ni lắc ở 150 vịng/ phút, 30oC trong 30-36 giờ , ly tâm ở 8000v/p trong 5 phút, thu sinh khối, sấy khô ở 80oC trong 4-5 giờ, tiến hành định lượng β-glucan sử dụng bộ kit megazyme để lựa chọn hàm lượng SDS và EDTA bổ sung thích hợp cho q trình tổng hợp β-glucan. Lặp lại ít nhất 3 lần cho mỗi thí nghiệm.
2.2.4.4. Lựa chọn thời gian nuôi cấy thu β-glucan
Sau khi đã lựa chọn được hàm lượng chất ức chế tiến hành lựa chọn thời gian ni cấy thích hợp để thu sinh khối nấm men giàu β-glucan. Cấy 5% giống cấy vào bình tam giác chứa 100ml mơi trường thích hợp mục (2.2.4). Ni cấy lắc ở nhiệt độ đã lựa chọn (mục 2.2.3.3) trong khoảng thời gian 24; 30; 36; 40; 48; 72 giờ. Sau đó, thu dịch ni cấy, ly tâm thu sinh khối, sấy khô và định lượng β-glucan để lựa chọn thời gian thích hợp cho q trình ni cấy thu sinh khối nấm men. Lặp lại 3 lần cho mỗi thí nghiệm.
2.2.5. Phương pháp thu hồi vách tế bào nấm men
Chúng tôi tiến hành cấy 5% dịch giống cấp 1 vào bình tam giác 2 lít chứa 1,5 lít mơi trường ni cấy có bổ sung chất ức chế với hàm lượng đã lựa chọn, lắc 150 vòng/phút trong 30 giờ ở 30oC. Hút 50 ml nhũ dịch nuôi cấy vào ống Falcon 50, ly tâm 6000v/p trong 5 phút. Loại bỏ phần dịch nổi, phần sinh khối nấm men được sử dụng để nghiên cứu thu hồi vách tế bào nấm men giàu β-glucan. Lặp lại 3 lần cho mỗi thí nghiệm.
2.2.5.1. Phá tế bào nấm men bằng kiềm nhiệt[12, 22, 45]
Thêm 10ml NaOH nồng độ thay đổi vào ống fancon chứa sinh khối nấm men đã chuẩn bị ở trên, lắc đều ở 60oC, nồng độ NaOH sử dụng thay đổi lần lượt là0,05; 0,1; 0,2; 0,5M với thời gian 24; 36; 48 giờ, sau đó ly tâm 8000v/p trong 10 phút để đánh giá khả năng phá vách tế bào nấm men. Lặp lại thí nghiệm 3 lần.
2.2.5.2. Phá tế bào nấm men bằng phương pháp enzyme [8, 10]
Thêm 5ml dung dịch đệm phosphat pH 6,0 vào ống fancon 50 chứa sinh khối nấm men đã ly tâm, lắc đều bằng máy vontex. Dịch sinh khối nấm men trong đệm được sử dụng để nghiên cứu phương pháp thu hồi vách tế bào nấm men giàu β- glucan. Các ống Falcon chứa dịch sinh khối được chúng tôi tiến hành xử lý nhiệt ở 100oC trong 5 phút sau đó tiến hành phá tế bào nấm men bằng phương pháp enzyme. Dịch phá tế bào được ly tâm ở 6000v/p trong 10 phút, loại bỏ dịch nổi, phần tủa dưới đáy là vách tế bào nấm men. Enzyme chúng tôi lựa chọn để tiến hành phá tế
bào nấm men gồm protease (Sigma) và chitinase (Megazyme) [8, 49] trong đó hàm lượng chitinase được thêm vào 0,1 mg/ml nhũ dịch.