Thời gian xử lý enzyme (giờ) Hàm lượng protease (mg/ml) 1 1,5 2,0 2,5 3,0 2 E1 E2 E3 E4 E5 4 E6 E7 E8 E9 E10
6 E11 E12 E13 E14 E15
8 E16 E17 E18 E19 E20
10 E21 E22 E23 E24 E25
Hàm lượng protease thêm vào được thay đổi lần lượt từ 1; 1,5; 2; 2,5; 3 mg/ml nhũ dịch sinh khối trong đệm phosphat pH 6,0. Ủ lắc ở 40oC, thời gian thay đổi từ 2 đến 10 giờ [8, 10] để lựa chọn thời gian và hàm lượng protease thích hợp. Định lượng protein để đánh giá khả năng phá vách tế bào nấm men.
2.2.5.3. Chiết vách tế bào nấm men giàu β-glucan
Hỗn dịch sinh khối nấm men sau xử lý phá tế bào được ly tâm 8000 v/p trong 10 phút, bỏ dịch nổi, thu lại phần lắng phía dưới, phần lắng này gồm vách nấm men giàu β-glucan và có thể có tạp chất như protein, ADN... do chưa được rửa sạch. Rửa phần lắng bằng dung dịch đệm citrat pH 7.0; dung dịch NaOH 10 mM; dung dịch H3PO4 10mM và dung dịch CH3COOH 10 mM [15, 23] 1 lần, 2 lần và 3 lần, ủ nhiệt độ phòng 1 giờ với các dung dịch sử dụng, sau đó ly tâm 8000 v/p trong 10 phút, bỏ phần dịch nổi, phần lắng được sấy khô ở 80oC trong 4-5 giờ, tiến hành định lượng β-glucan để đánh giá khả năng chiết của các dung dịch
2.2.6. Thử nghiệm trên thiết bị nuôi cấy 30 lit
Nuôi cấy thử nghiệm chủng BM 32 trên thiết bị ni cấy có chứa 20 lít mơi trường thích hợp cho thu sinh khối nấm men giàu β-glucan, cấy 5% giống cấy. Sau thời gian nuôi cấy, tiến hành thu sinh khối nấm men, ly tâm ở 8000v/p trong 10
phút. Phá tế bào nấm men và chiết vách nấm men giàu β-glucan (mục 2.2.5). Toàn bộ lượng vách sau chiết được sấy khô cân khối lượng và định lượng β-glucan, lặp lại thí nghiệm 3 lần.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN VÀ PHÂN LOẠI CHỦNG NẤM MEN GIÀU Β-GLUCAN CÓ NGUỒN GỐC TỰ NHIÊN GLUCAN CÓ NGUỒN GỐC TỰ NHIÊN
3.1.1. Phân lập và tuyển chọn nấm men
Mục đích của đề tài là nghiên cứu phương pháp thu hồi β-glucan từ tế bào nấm men phân lập từ tự nhiên. 12 mẫu phân lập gồm mẫu bánh men, hoa quả chín, men rượu được thu thập từ các vùng quanh khu vực Hà Nội. Các mẫu bánh men, hoa quả chín sau khi được thu thập sẽ được bảo quản và tiến hành xử lý, phân lập theo phương pháp pha loãng trên đĩa thạch Hansen có bổ sung cloramphenicol 50mg/l, ủ 48 giờ ở 25-300C. Quan sát thấy xuất hiện các khuẩn lạc khác nhau, có cả nấm mốc và nấm men.Chúng tơi chọn khuẩn lạc nghi ngờ là nấm men đem nuôi cấy thuần khiết và bảo quản để tiếp tục nghiên cứu, tạm gọi mỗi khuẩn lạc riêng rẽ đó là chủng và phân lập được 112 chủng nấm men.Các chủng phân lập được nuôi cấy trong 100 ml môi trường Hansen lỏng ở 30oC, lắc 150 vòng/ phút trong 30 giờ. Sau 30 giờ,ly tâm ở 6000 v/p trong 10 phút, bỏ dịch nổi, phần lắng phía dưới là sinh khối nấm men, thu phần lắng sinh khối và sấy khô trong 2-4 giờ ở 80oC. Đánh giá sơ bộ khả năng sinh trưởng của nấm men bằng phương pháp cân sinh khốiđểlựa chọn các chủng nấm men phát triển tốt, loại bỏ các chủng nấm men phát triển kém.