Chương 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1.4. Phương pháp địnhlượng protein: Phương pháp Lowry
Dựng đường chuẩn BSA
Bảng 2.1. Giá trị OD750nm của dung dịch BSA ở các nồng độ khác nhau Nồng độ BSA (μg/ml) Dung dịch stock(μg) H2O (μl) OD750nm
50 150 2850 0,111 100 300 2700 0,203 150 450 2550 0,290 200 600 2400 0,350 250 750 2250 0,424 300 900 2100 0,512 350 1050 1950 0,567 400 1200 1800 0,584 450 1350 1650 0,626 500 1500 1500 0,750 - Chuẩn bị hóa chất: + WS1: dung dịch NaOH 2N + WS2: Thuốc thử Folin 1N
+ WS3 - hỗn hợp thuốc thử tạo phức (pha trước khi sử dụng): Trộn 100mg CuSO4.5H2O và 200mg KNaC4H4O6.4H2O. Hòa tan hỗn hợp này trong 50ml H2O. Tiếp theo, hòa tan 10g Na2CO3 trong 50ml H2O. Trộn 2 dung dịch trên lại với nhau
được dung dịch (V1). Chuẩn bị dung dịch NaOH 3.2% (V2) và SDS 5% (V3). Trộn 3 dung dịch V1, V2, V3 ở trên theo tỉ lệ 1:1:2 về thể tíchđược WS3.
Hịa 0,01 g protein BSA vào 10 ml H2O (stock với nồng độ BSA 1 mg/1ml). Dung dịch stock được trộn với nước theo số liệu dưới bảng thu được nồng độ BSA tương ứng.Lấy 1ml dịch vừa pha với 1ml WS3 ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Bổ sung 500 µl WS2, ủ ở nhiệt độ phịng trong 30 phút. Đo OD ở bước sóng 750nm.
Hình 2.1. Đường chuẩn BSA
Định lượng protein
Protein được định lượng theo phương pháp Lowry dựa trên đường chuẩn BSA. Thêm 1 ml WS1 vào 1 ml dịch protein cần định lượng, thủy phân ở 100ºC trong phút. Để nguội về nhiệt độ phòng, thêm 1 ml WS3, ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Tiếp tục bổ sung 500µl WS2, trộn đều mẫu, ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Mật độ quang (OD) của hỗn hợp này được xác định ở bước sóng 750 nm. Dựa vào đường chuẩn BSA (hình 2.1), nồng độ protein được tính theo cơng thức: