2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị sử dụng
2.1.1. Nguyên liệu
Mẫu đất được lấy trên bề mặt và xác rệp chết bởi nấm gây bệnh trên đồng ruộng được thu thập ở cánh đồng mía phường Đồng Mai, quận Hà Đơng, Hà Nội. Các mẫu sau khi thu thập được chúng tơi bảo quản tại phịng Cơng nghệ sinh học môi trường, Viện Công nghệ sinh học, Viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Thử nghiệm sinh học: Rệp muội hại cây ngô được thu thập từ cánh đồng ngô
ở bãi bồi sơng Hồng, Hà Nội đem về phịng thí nghiệm nhân giống. Dựa vào đặc điểm hình thái và cây chủ, rệp này bước đầu được nhận định thuộc loài Aphis maydis.
2.1.2. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
Các hóa chất sử dụng đều là hóa chất ngoại nhập của các hãng Sigma, Merk, Invitrogen, Prolab, ICN…
Một số vật liệu cần thiết khác như: khoai tây, lá ngô, gạo, cám gạo, bột ngô, lõi ngô được mua và thu thập tại khu vực Hà Nội.
Chuẩn bị chitin huyền phù 1%: 1g bột chitin được thêm từ từ vào 20 ml dung
dịch HCl đậm đặc, khuấy đều và ủ trong 8 giờ. Thêm vào hỗn hợp 200 ml ethanol lạnh (-20oC) và để qua đêm. Ly tâm hỗn hợp ở 4000 vòng/phút, trong 20 phút, thu lấy kết tủa và rửa bằng đệm phosphate 0,05 M cho đến khi đạt pH trung tính thì dừng lại. Thêm vào tủa 100 ml dung dịch đệm trên cho đến khi thể tích đạt 100 ml.
Thuốc thử DNS (3,5-Dinitrosalicylic acid): Cân 5 g DNS bổ sung thêm 300
ml nước cất, đun từ từ đến khoảng 50o
C. Tiếp tục bổ sung 8 g NaOH, khuấy đều, cho thêm 150 g muối Tartrate (Sodium potassium tartrate- KNaC4H4O6). Bổ sung từ từ nước cất cho đến thể tích 500 ml. Đun dần cho đến 100oC, lắc đều cho đến khi các hóa chất tan hết.
2.1.3. Thiết bị
Trong quá trình nghiên cứu, các thiết bị, máy móc đã được sử dụng có độ chính xác cao tại phịng Cơng nghệ sinh học mơi trường, phịng Các chất chức năng sinh học và phịng thí nghiệm trọng điểm Quốc gia về công nghệ Gene- Viện Công nghệ sinh học, viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Bảng 2.1. Danh mục các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm
Tên thiết bị Xuất xứ
Cân OHAUS PA213 Mỹ
Máy đo pH HANA HI 2211 PH/ORP Meter Ý
Máy đo UV-VIS 752N, Trung Quốc
AB applied Biosystems, Gene Amp PCR system 2700, Singapore
Khuấy từ gia nhiệt AHY Trung Quốc
Bể ổn nhiệt BUCHI Thụy Sỹ
Nồi khử trùng HVE-50 Nhật Bản
Tủ Lạnh 4 ºC, -20ºC, -80oC Liên doanh
Tủ lắc ổn nhiệt Wis-10R Hàn Quốc
Lị vi sóng 20 lít, 30 lít Liên doanh
Máy li tâm bàn KUBOTA’2010 Nhật Bản
Máy điện di ngang ADN-Biorad Mỹ
Kính hiển vi Nikon elipse 80i Nhật Bản
Hệ thống chụp ảnh gel-doc Waltec (Đài Loan)
Tủ cấy vô trùng Laminar Pháp
Vortex
Tủ lên men rắn Biose, Ldt 1000 l
Trung Quốc Liên doanh
2.1.4. Môi trường nuôi cấy
Các loại môi trường nuôi cấy cơ bản được sử dụng trong nghiên cứu được trình bày ở bảng 2.2.
Bảng 2.2. Các loại môi trường nuôi cấy cơ bản
PDB cải tiến (Potato dextrose broth ) (g/l) Môi trường LB dịch (g/l)
Dịch chiết khoai tây : 200 g NaCl : 10 g
Glucose : 20 g Tryptone : 10 g
KNO3 : 0,5 g Cao men : 5 g
Nước cất vừa đủ pH : 1 lít : 5,5 - 6 Nước cất vừa đủ : 1 lít pH : 7- 7,2
PDA cải tiến (Potato dextrose agar) (g/l) Môi trường lỏng sinh chitinase (g/l)
Thành phần các loại hóa chất giống PDB nhưng có thêm 18-20 g Agar
Dịch chiết khoai tây NaNO3 : 20 g : 2 g Dung dịch Tween 80 (0,05%) KH2PO4 : 1 g Hút 500 µl tween 80 và định mức đến 1lít bằng nước cất KCl : 0,5 g FeSO4 : 0,01 g
Nước muối sinh lý (0,85%) NaCl : 1 g
NaCl : 8,5 g Bột chitin : 10 g
Nước cất vừa đủ : 1 lít Nước cất vừa đủ : 1 lít
pH : 7 pH : 6,5
Các môi trường được cân cẩn thận và được khử trùng ở 1210
C trong 30 phút.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp phân lập nấm
Phân lập nấm từ xác rệp chết bởi nấm
Xác rệp chết bởi nấm gây bệnh được thu nhặt trên đồng ruộng, được đựng trong túi lynon sạch mang về phịng thí nghiệm. Xác côn trùng được ngâm trong cồn 70% (v/v) 2 phút, sau đó lấy ra và rửa (2 lần) bằng nước cất khử trùng. Đặt xác rệp vào đĩa PDA có chứa hỗn hợp kháng sinh (100 mg/l ampecillin; 100 mg/l tetracycline), ủ đĩa nấm ở nhiệt độ 30oC trong 3-5 ngày. Khi nấm mọc lên các khuẩn lạc, dùng mũi dao nhỏ cắt và cấy chuyển sang đĩa PDA mới. Chủng nấm sợi được tách sạch và tiến hành quan sát hình thái khẩn lạc.
Phân lập nấm từ mẫu đất
Cân 1g đất cho vào 10 ml nước muối sinh lý. Sau đó, hút 0,5 ml dịch vừa pha loãng trên sang lọ penicillin chứa 4,5 ml dịch sinh lý (ký hiệu là 10-1) và tiến hành đảo trộn đều. Tiếp đó, hút 0,5 ml dịch từ lọ penicillin 10-1
sang lọ penicillin 10-2 (chứa 4,5 ml dịch sinh lý) rồi đảo trộn. Quá trình được thực hiện tương tự tới 10-8.
Sau khi pha loãng tới 10-8, hút lần lượt 0,1 ml từ các lọ penicillin từ 10-8 tới 10-1 vào đĩa thạch PDA có bổ sung kháng sinh được chuẩn bị ở trên và tiến hành cấy gạt. Các đĩa sau khi được cấy gạt được bao gói cẩn thận và ni cấy ở nhiệt độ 30oC trong 3-5 ngày. Tập đồn các chủng nấm sợi trên mơi trường PDA được tách sạch riêng từng chủng và tiến hành quan sát hình thái khuẩn lạc.