CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.5. Ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của
3.5.8. Ảnh hưởng của thời gian lên men
ni cấy càng lâu thì hoạt tính enzyme càng giảm. Vì vậy, khi thời gian lên men để đạt hoạt tính chitinase cao nhất càng ngắn thì chi phí sản xuất càng thấp.
Chủng Penicillium sp. M4 có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao nhất sau 5 ngày lên men với (8,02 ± 0,02) U/ml (P< 0,01), được thể hiện ở bảng phụ lục 10 và hình 3.15). Sau 4 ngày lên men, hoạt tính chitinase đạt được tương đối cao (6,68 ± 0,02) U/ml, bằng 83% hoạt tính chitinase tối đa đạt được sau 5 ngày. Tiếp tục kéo dài thời gian lên men đến 6, 7, 8, 9 ngày, hoạt tính chitinase bắt đầu giảm mạnh từ (6,11 ± 0,01) U/ml xuống còn (1,67 ± 0,02) U/ml. Số liệu trên cho thấy thời gian ni cấy càng lâu hoạt tính enzyme càng giảm.
Hình 3.15. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của chủng nấm Penicillium sp. M4.
Kết quả trên tương đương với nghiên cứu của Lee và cộng sự (2009) về chủng Penicillium sp. LYG 0704 có hoạt tính cao nhất sau 3 ngày lên men [43].
Như vậy, các điều kiện ni cấy thích hợp cho sự sinh tổng hợp chitinase của chủng nấm Penicillium sp. M4 đã được tối ưu trong môi trường lên men rắn: với
nguồn cơ chất bột ngô với độ dày 17 mm, độ ẩm cơ chất 60%, pH 6, bổ sung 1% cơ chất chitin cảm ứng và 0,9% urê làm nguồn nitơ vô cơ, thời gian lên men là 5 ngày ở nhiệt độ 30o
C, hoạt tính chitinase cao nhất của chủng nấm là (8,02 ± 0,02) U/ml. So sánh kết quả khi lên men của chủng nấm Penicillium sp. M4 với cơ chất bột ngơ, hoạt tính chitinase đạt được sau khi tối ưu các điều kiện nuôi cấy đã tăng
1,33 lần, từ (6,05 ± 0,06) U/ml lên (8,02 ± 0,02) U/ml và tăng 1,44 lần so với khi nuôi chủng nấm ở môi trường sinh chitinase lỏng, từ 5,56 U/ml lên 8,02 U/ml.
Hoạt tính chitinase của chủng nấm Penicillium sp. M4 đạt được tương đối cao so với một số nghiên cứu về hoạt tính chitinase của nấm Penicillium khác trên thế giới. Trong nghiên cứu của Aghaeizadeh và cộng sự (2008) hoạt tính chitinase đạt được 21/18 U/ml sau khi tối ưu các điều kiện nuôi cấy [20].
Với các nguồn nguyên liệu được chọn bao gồm bột ngơ, urê, kết quả này có tính khả thi cao khi áp dụng vào thực tế vì các nguyên liệu này rẻ tiền và sẵn có. Bên cạnh đó, phương pháp lên men rắn dễ vận hành, chi phí đầu tư và vận hành thấp lại đạt được năng suất cao.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
1. Từ mẫu đất và xác rệp chết bởi nấm, chúng tôi đã phân lập được 6 chủng nấm có khả năng phát triển trên môi trường PDA. Trong đó, chủng nấm NM4 có độc lực diệt rệp ngô cao nhất với (92,3 ± 2,1)% sau 7 ngày phun, với số lượng 108 bào tử/ml, ở 30oC, độ ẩm 70%.
2. Chủng nấm NM4 có khuẩn lạc trịn, khuẩn ty khí màu trắng, D: 2,5 cm. Dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 40 lần, bào tử trần có hình elip, màu xanh nhạt, khơng có vách ngăn, bề mặt tròn nhẵn. Dựa vào đặc điểm hình thái khuẩn lạc và so sánh trình tự đoạn gene mã hóa 18S rRNA (100%) với các chủng thuộc chi Penicillium nên chủng này được đặt tên là Penicillium sp. M4. Chủng nấm này được đăng ký trên ngân hàng Genbank (NCBI) với mã số JX145346.
3. Chủng nấm ký sinh cơn trùng Penicillium sp. M4 có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao trên môi trường rắn với nguồn cơ chất bột ngơ có độ dày 17 mm, độ ẩm cơ chất 60%, 1% cơ chất chitin cảm ứng, pH 6, nồng độ urê 0,9%, nhiệt độ 30oC trong thời gian ni cấy 5 ngày. Hoạt tính chitinase đạt trong điều kiện lên men tối ưu là (8,02 ± 0,02) U/ml tăng 1,33 lần so với nguồn cơ chất bột ngô chưa được tối ưu.
Kiến nghị
1. Phun thử nghiệm trên đồng ruộng với quy mô nhỏ để đánh giá hiệu quả diệt rệp ngô của chế phẩm bào tử nấm Penicillium sp. M4.
2. Tinh sạch chitinase và đánh giá tính chất lý hóa của chitinase thu được từ chủng nấm Penicillium sp. M4.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt
1. Nguyễn Thuỳ Châu, Trương Thanh Bình, Bùi Thị Hương, Trần Văn Tuân, Lê Hữu Hiếu, Đỗ Ngọc Huyền, Nguyễn Ngọc Huyền, Nguyễn Thị Hồng Hà (2000), “Nghiên cứu công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu vi sinh phịng trừ cơn trùng từ các chủng Bacillus thuringiensis”, Tạp chí Nơng nghiệp Công nghiệp Thực phẩm,
(8/2000), tr. 359-361.
2. Tạ Kim Chỉnh, Nguyễn Thị Hồng Hạnh, Hoa Thị Minh Tú (2004), Phân tích trình tự gen r28S của chủng nấm Metarhizium Ma2RN phân lập ở Việt Nam.
Báo cáo khoa học, Hội nghị toàn quốc, NXB Khoa học và Kỹ Thuật, Hà Nội. 3. Nguyễn Thị Thu Cúc (2009), Côn trùng nông nghiệp, phần A: Côn trùng đại
cương, NXB Đại học Cần Thơ.
4. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1980), Vi sinh vật học
tập 2, NXB Đại học và trung học chuyên nghiệp Hà Nội, Hà Nội.
5. Đặng Tiến Đông (2010), Sản xuất chitin-chitosan từ vỏ tôm, Đại học kĩ thuật thành phố Hồ Chí Minh.
6. Nguyễn Thị Hà (2012), “Tối ưu điều kiện nuôi cấy chủng Aspergillus protuberus sinh tổng hợp enzym chitinase được phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ”, Tạp chí Khoa học- Đại học Cần Thơ, 22b, tr. 26-35.
7. Đinh Minh Hiệp (2007), Hệ chitinase của Trichoderma và vai trị trong kiểm sốt sinh học, Báo cáo chuyên đề nghiên cứu sinh, Trường Đại học Khoa học Tự
nhiên Thành phố Hồ Chí Minh.
8. Lê Thị Huệ (2010), Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase của một
số chủng nấm sợi thuộc giống Aspergillus, Trichoderma và ứng dụng, Luận văn
Thạc sĩ, Đại học sư phạm thành phố Hồ Chí Minh.
9. Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2006), Thí nghiệm cơng nghệ sinh học tập 2, NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh, TP Hồ Chí
Minh.
11. Nguyễn Hồng Minh, Nguyễn Ngọc Mai, Vũ Văn Hạnh (2013), Tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase chủng nấm kí sinh cơn trùng Lecanicillium đột biến, Báo cáo khoa học, Hội nghị công nghệ sinh học toàn
quốc 2013, NXB Khoa học tự nhiên và công nghệ, Hà Nội.
12. Lê Minh Nguyệt, Phan Thị Phương Thảo, Xây dựng quy trình sản xuất giống khởi động cho sản xuất chao từ nấm mốc Mucor elegans (2012), Tạp chí Khoa học và Phát triển, 10 (5), tr. 771-778.
13. Nguyễn Quang Nhân (2009), Nghiên cứu, thu nhận và xác định tính chất của chitinase từ mủ cây cao su Heveabrasiliensis, Luận văn thạc sỹ sinh học, trường
đại học Khoa học tự nhiên.
14. Võ Thị Thu Oanh, Lê Đình Đơn, Bùi Cách Tuyến (2007), “Đặc điểm sinh học và khả năng gây bệnh của nấm Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin đối
với sâu khoang (Spodoptera litura F.) hại rau cải xanh (Brassica juncea L.”,
Tạp chí khoa học kỹ thuật Nông Lâm nghiệp- Đại học Nông Lâm Tp. HCM,
(1&2), tr. 58-63.
15. Lê Xuân Phương (2008), Vi sinh vật học môi trường, Đại học Bách Khoa Đà
Nẵng.
16. Nguyễn Văn Sơn, Nguyễn Anh Diệp (2001), “Hiệu lực của một số loại thuốc trừ sâu sinh học đối với sâu tơ và sâu khoang hại rau họ hoa thập tự”, Tạp chí
Nơng nghiệp và Phát triển Nông thôn, (9/2001), tr. 624-625.
17. Quyền Đình Thi, Vũ Văn Hạnh, Lê Thị Thùy Dương (2012), “Độc tính của nấm kí sinh cơn trùng đối với rệp hại ngô Aphis Maydis ở các chế độ nhiệt độ và độ ẩm”, Tạp chí Khoa học và cơng nghệ, Hội nghị các nhà khoa học trẻ toàn quốc
trong lĩnh vực khoa học tự nhiên và công nghệ, 50 (3D), tr. 999- 1005.
18. Nguyễn Thị Hồng Thương, Đồng Thị Thanh Thu, Đinh Minh Hiệp (2003),
Khảo sát một số yếu tố tác động quá trình sinh tổng hợp hệ enzyme chitinase của các chủng nấm mốc Trichoderma spp., Báo cáo khoa học Hội nghị toàn
quốc lần thứ II Nghiên cứu cơ bản trong sinh học, nông nghiệp và y học tại Huế, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
Tiếng anh
19. Abbott W. S. (1925), “A method for computing the effectiveness of an insecticide”, J Econ Entomol, 18, pp. 256-267.
20. Agheizadeh Fatemeh., Faezi Ghasemi M., Ghasemi M., Ghaemi N., Dastan K. (2008), “Optimization of chitinase production by Penicillium aculeatum PTCC 5167 in submerged culture fermentation”, J Bio Sci, 2(2 (SERIES NO. 5)), pp. 13-24.
21. Akhtar L. H., Hussain M., Iqbal R. M., Amer M. (2010), “Losses in grain yield caused by russian wheat aphid Diuraphis noxia (Mordvilko)”, Sarhad J Agric,
26(4), pp. 625-628.
22. Alavo T. B. C., Sermann H., Bochow H. (2002),”Virulence of strains of the entomopathogenic fungus Verticillium lecanii to aphids: strain improvement”, Arch Phytopath Pflanz, 34 (6), pp. 379- 398.
23. Arthur Felse P., Panda T. (1999), “Self-directing optimization of parameters for extracellular chitinase production by Trichoderma harzianum in batch mode”.
Process Biochem, 6-7(34), pp. 563-566.
24. Baysal Z., Uyar F., Aytekin C. (2003), “Solid state fermentation for production of α-amylase by a thermotolerant Bacillus subtilis from hot- spring water”.
Process Bichem, 38, pp. 1665-1668.
25. Behura B. K., Bohidark. (1983), “Effect of temperature on the fecundit of five species of aphids”, Pranikee, 4, pp. 23-27.
26. Blackman R. L., Eastop V. F. (1984), Aphids on the world’s crops: An identification and information guide, Chichester West Sussex and New York,
New York.
27. Bodenheimer F. S., and Swirski E. (1957), The Aphidodea of the Middle Eas,
The Weizmann Science Press of Israel, Jerusalem.
28. Brar N. S., Bakhetia D. R. C., Sekhon B. S. (1987), “Estimation of losses in yield of rapeseed and mustard due to mustard aphid”, Lipaphis erysimi (Kalt.), J
29. Carena M., Glogoza P. (2004) “Resistance of maize to the corn leaf aphid: A review”, Maydica, 49, pp. 241-254.
30. Catangui M. A., Beckendorf E. A., Riedell W. E. (2009), “Soybean aphid population dynamics, soybean yield loss, and development of stage-specific economic injury levels”, Agron J, 101(5), pp. 1080-1092.
31. Carrasco- Tauber C. (1989), Pesticide Productivity Revisitef, M. S. Thesis,
Amherst, MA, University of Massachusetts.
32. Charnley A. K., St Leger R. J. (1991), The role of cuticle-degrading enzymes in
fungal pathogenesis in insects, in Fungal spore disease initiation in plants and animals, Cole G. T., and Hoch H. C., Editors, New York Plenum Press, pp. 267-
287.
33. Damalas C. A. (2009), “Understanding benefits and risks of pesticide use”, Sci Res Essay, 4(10), pp. 945- 949.
34. De-hui D., Wei-lian H., Guang-rong H., Wei Li. (2011), “Purification and characterization of a novel extracellular chitinase from thermophilic Bacillus sp. Hu1”, African Journal of Biotechnology, 10(13), pp. 2476-2485.
35. Dimbi S., Maniania N. K., Lux A. S., Ekesi S., Mueke K. J. (2003), “Pathogenicity of Metarhizium anisopliae (Metsch) Sorokin and Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin, to three adult fruit fly species: Ceratitis capitata
(Wiedemann), C. rosa var. Fasciventris Karsch and C.cosyra (Walker) (Diptera: Tephritidae)”, Mycopathologia, 156(4), pp. 375-382.
36. George C. M., Ken P. M. (1993), Bugs of the World, Of the World Series, Facts on File, New York.
37. Goettel M. S., Koike M., Kim J. J., Aiuchi D., Shinya R., Brodeur J. (2008), “Potential of Lecanicillium spp. for management of insects, nematodes and plant diseases”, J Invertebr Pathol, 98(3), pp. 256- 261.
38. Guthrie J. L., Khalif S., Castle A. J. (2005), “An improved method for detection and quantification of chitinase activities”, Canadian Journal of Microbiology, 51(6), pp. 491-495.
39. Hall R. A., Burges H. D. (1979), “Control of aphids in glasshouses with the fungus, Verticillium lecanii”, Ann Appl Biol, 93(3), pp. 235-236.
40. Hajek R. A., St Leger R. J. (1994), “Interactions between fungal pathogens and insect hosts”, Ann Rev Entomol, 39, pp. 293-322.
41. Hsiao W. F., Bidochka M. J., Khachatourians G. G. (1992), “Effects of diphenols on growth of three entopathogenic fungi”, Candian Journal of Microbiology, 38(9), pp. 1000-1003.
42. Huang C. J., Wang T. K., Chung S. C., Chen C. Y. (2005), “Identification of an Antifungal Chitinase from a Potential Biocontrol Agent Bacillus cereus 28-9”, J
Biochemistry Molecular Biology, 38(1), pp. 82-88.
43. Lee Y. G., Chung K. C., Wi S. G., Lee J. C., Bae H. J. (2009), “Purification and properties of a chitinase from Penicillium sp. LYG 0704”, Protein Expresion and Purification, 65(2), pp. 244-250.
44. Madelin M. F. (1963), “Diseases caused by Hyphomycetous fungi”, In E. A. Steinhaus [ed.]. Insect Pathology: An Advanced Treatise, Academic Press, NY,
2, pp. 233-271.
45. Marianski S., Marianski A., (2009), The art of making fermentated sausages,
Bookmagic LLC.
46. Meyer S. L. E., Johnson G., Dimock M., Fahey J. W., Huettel R. N. (1997), “Field efficacy of Verticillium lecanii, sex pheromone, and pheromone analogs
as potentisal management agents for soybean cyst nematode”, J Nematol, 29(3), pp. 282- 288.
47. Millner T. C., Gubler W. D., Laemmlen F. F., Geng S., Rizzo D. M. (2004), “Potential for using Lecanicillium lecanii for suppression of strawberry powdery mildew”, Biocontrol Sci Technol, 14(2), pp. 215- 220.
48. Miner R. J., Pierrard G., Baw A., Myochit. (1992), “The potential of Metarhium
anisopliae for the control of Scarab pest Management”, pp. 277-280.
49. Moazami N. (2002), “Biopesticides production”, Encyclopedia of Biological physiological and Heath Sciences, Encyclopedia of Life Support Systems, pp.1-
50. Monreal J., Reese E. T. (1969), “The chitinase of Serratia marcescens”, Can. J.
Microbiol, 15 (7), pp. 689-690.
51. Moore D., Bridge P. D., Higggins P. M., Bateman R. P., Prior G. (1993), “Ultraviolet radiation damage to Metarhizium flavoviridae conidia and the
protection given by vegetable and mineral oils and chemical sunscreens”, Annals
of Applied Biology, 122(3), pp. 605- 616.
52. Moorhouse E. R., Gillespie A. T. (1992), “Influence of fungicides and insecticides on the entomogenuos fungus Metarhizium anisopliae a pathogen of the vine weevil Otiorhynchus sunlcatus”, Bioscience and Technology, 2(49), pp. 49-59
53. Moo Y. M., Moreira A. R., Tengerdy R. P. (1983), “Principles of soild substrate fermentation”, Fungal Technology, Edward Arnold, London, 4, pp. 117-144. 54. Nene Y. L., Reddy M. V. (1976), “Preliminary information on chickpea stunt”,
Tropical Grain Legume Bulletin, 5, pp. 31-32.
55. Ouakfaoui S. E., Asselin A. (1992), “Multiple forms of chitinase activities”,
Phytochemistry, 31, pp. 1513- 1518.
56. Parameswaran B., Tunde P., Viviana N., Chandran S., George S., Istvan P., Ashok P. (2005), “Production and purification of extracellular chitinases from
Penicilium aculeatum NRRL 21 under solid-state fermentation”, Enzyme Microbial Technol, 7(36), pp. 880-887.
57. Patel S. R., Awasthi A. K., Tomar R. K. S. (2004), “Assessment of yield losses in mustard (Brassica juncea L.) due to mustard aphid (Lipaphis erysimi Kalt.) under differrent thermal environments in Eastern Central India”, Appl Eco Environ Res, 2(1), pp. 1-15.
58. Patidar P., Agrawal D., Banerjee T., Patil S. (2005), “Optimisation of process parameters for chitinase production by soil isolates of Penicillium chrysogenum under solid substrate fermentation”, Process Biochem, 40(9), pp. 2962-2967 59. Pimentel D., Acquay H., Biltonen M., Rice P., Silva M., Nelson J., Lipner V.,
and economic impacts of pesticide use”, The Pesticide Question: Environment, Economic and Ethics, Chapman & Hall, NewYork, pp. 47-84
60. Pimentel D. (1997), “Pest management in agriculture”, Techniques for Reducing
Pesticide Use: Enviromental and Economic Benefits, John Wiley & Sons,
Chichester, UK, pp. 1-11
61. Raimbault M. (1998), “General and microbiological aspects of soild substrate fermentation”, Electron J Biotechnol, 1(3), pp.1-15.
62. Ramesh M.V., Lonsane B.K. (1987), “Solid State fermentation for production of alpha amylase by Bacillus megaterium 16 M”, Biotechnol Lett, 5(9), pp. 323-
328.
63. Rath A. (1995), “Termite meets fungus- fungus eats termite, bio- blast- a new biological tool for your termite control programs”, Pest Control, 63, pp. 42-43. 64. Razaq M., Mehmood A., Ismail M., Afzal M., Ali-Shad S. (2011), “Losses in
yield and yield components caused by aphids to late sown Brassica napus L., Brassica juncea L. and Brassica carrinata A. at Multan, Punjab (Pakistan)”, Pak J Bot, 43(1), pp. 319-324.
65. Riedell W. E., Tinney J. C., Macgregor J. T., Starlert N. J. (1978), “Pesticide use in agriculture”, Environ Heath Perspect, 27, pp. 103-112.
66. Rifkind D., Freeman G. (2005), The Nobel Prize Winning Discoveries in Infectious Diseases, Academic Press, Lon Don.
67. Roberti R., Ghisellini L., Innocenti G. (1993), “Biological control of blackeg of beetle (Phomabetae) by Metarhiziumanisopliae”, Zeitschriftfur Pflanzenkrrankheeitn und Pflanzenschutz, 100(2), pp. 203-210.
68. Sherief A. A., El-Sawah M. M. A., Abd El-Naby M. A. (1991), “Some properties of chitinase produced by a potent Aspergillus carneus strain”, Appl Microbiol Biotechnol, 35, pp. 228-230.
69. Shuhui L., Mok Y. K., Wong W. S. (1992), “Role of Mammalian Chitinases in Asthma”, Int Arch Allergy Immunol, 149 (4), pp. 369–377.
71. Thackray D. J., Diggle A. J., and Berlandier F. A. (2004), “Forecasting aphid