Chitin là một trong các polymer sinh học phổ biến nhất trong tự nhiên chỉ đứng sau cellulose (cấu trúc hóa học của chitin gần giống với cellulose) và đóng vai trị là polysaccharide cấu trúc của các sinh vật như: thành tế bào của nấm, khung vỏ ngoài của động vật chân đốt, vỏ ngoài của các loài giáp xác và giun trịn. Trong cấu trúc của chitin, nhóm (-OH) ở nguyên tử C2 được thay thế bằng nhóm axetyl amino (-NHCOCH3).
Liên kết β-(1-4)-glycosyl của mỗi đơn phân trong cấu trúc của chitin lệch nhau một góc 180o tạo nên mạch xoắn và loại liên kết này kém bền, dễ bị cắt đứt bởi tác nhân có tính axit hay enzyme [42].
1.4.5. Các nguồn thu nhận chitinase
Chitinase hiện diện ở hầu hết các giới sinh vật như: vi khuẩn, xạ khuẩn, thực vật hay trong các loài động vật khơng xương sống, có xương sống [55].
Chitinase được tìm thấy trong vi khuẩn Chromobacterium, Klebsiella, Pseudomonas, Clostridium, Vibrio, Bacillus và đặc biệt ở nhóm Streptomycetes [5].
Chitinase cũng được tạo ra bởi các loài nấm sợi thuộc các chi Trichoderma,
Aspergillus, Gliocladium, Calvatia… và cả ở các nấm lớn như Lycoperdon, Coprinus... Tương tự như vi khuẩn, chitinase của nấm đóng vai trị quan trọng về mặt dinh dưỡng, nhưng khác là hoạt động của chúng rất linh hoạt trong quá trình phát triển và trong sự phát sinh hình thái của nấm bởi vì chitin là thành phần chính của vách tế bào nấm. Chitinase cịn giữ vai trị chính trong hoạt động ký sinh nấm đối kháng lại các loài nấm gây bệnh thực vật.
Chitinase được thực vật tổng hợp nhằm mục đích chống lại các nấm ký sinh gây bệnh cho cây trồng. Những thực vật bậc cao có khả năng tạo chitinase như thuốc lá (Nicotiana sp.), cà rốt, đậu nành (hạt), khoai lang (lá)... và đặc biệt một số loài tảo biển cũng là nguồn cung cấp enzyme chitinase [13].
Từ một số động vật nguyên sinh, từ các mô và tuyến khác nhau trong hệ tiêu hóa của nhiều lồi động vật khơng xương như ruột khoang, giun tròn, thân mềm, chân đốt... có thể thu nhận được chitinase. Đối với động vật có xương sống, chitinase được tiết ra từ tuyến tụy và dịch dạ dày của các lồi cá, lưỡng cư, bị sát ăn sâu bọ, trong dịch dạ dày của những loài chim, thú ăn sâu bọ.
Ngoài ra, chitinase còn được thu nhận từ dịch biểu bì của giun trịn trong suốt q trình phát triển và dịch tiết biểu bì của các lồi chân đốt vào thời điểm thay vỏ, lột da. Chitinase giúp cơn trùng tiêu hóa màng ngồi (cuticun) của chúng trong q trình biến thái hay lột xác [13].
1.4.6. Ứng dụng của chitinase
Chitinase đã và đang được quan tâm và nghiên cứu nhiều trên thế giới do có khả năng ứng dụng rộng lớn. Chitinase được sử dụng trong nhiều ứng dụng khác nhau trong y học, công nghiệp, nông nghiệp và nghiên cứu. Đánh dấu các hạt vàng trên chitinase và chitosanase giúp các nhà khoa học định vị chitin và chitosan trong nghiên cứu cấu trúc, hóa học tế bào và miễn dịch học. Trong cơng nghiệp, chitinase được sử dụng để sản xuất các loại chitooligosaccharide, N-acetyl D-glucosamine có chức năng kháng khuẩn, kích thích enzyme lysozym hoạt động và tăng cường miễn dịch. Ngoài ra, chitinase được ứng dụng tạo ra các protein đơn bào; tạo ra các thể nguyên sinh (protoplast) của nấm mốc, nấm men; diệt các nấm gây bệnh; xử lý các chất thải giàu chitin; kiểm sốt q trình lây nhiễm của mầm gây bệnh sốt rét.
Trong công tác bảo vệ thực vật, người ta đã đạt được nhiều kết quả tốt trong việc dùng một số lồi nấm phịng trừ sâu bệnh hại cây trồng. Cụ thể như nấm
Metarhizium anisopliae dùng phòng trừ sâu xám, sâu đục thân ngô, sâu đục nõn dừa. Nấm Beauveria bassiana trừ trên 80 loại sâu hại khác nhau, trong đó có sâu đục thân ngô, bọ xít, bọ hung... Phần lớn các loài nấm xâm nhập vào cơ thể sâu bằng sợi nấm xuyên qua lớp vỏ cutincun (phức hệ protein-chitin) vào trong. Các vòi nấm tiết ra chitinase phân giải chitin tạo thành một lỗ để xâm nhập vào trong… Các nhà khoa học đã chứng minh mối liên hệ giữa khả năng tiêu diệt sâu bệnh của vi nấm đối kháng và sự tổng hợp chitinase ở các lồi vi nấm này.
1.5. Cơng nghệ lên men lỏng và lên men xốp
Để sản xuất chế phẩm diệt cơn trùng trước tiên phải có bào tử nấm ký sinh côn trùng. Tuy nhiên, để tăng hiệu quả của chế phẩm sinh học người ta thường bổ sung một lượng lớn enzyme vào chế phẩm, trong đó phải kể đến chitinase. Vì vậy, việc lựa chọn phương pháp lên men và tối ưu các điều kiện lên men là rất cần thiết để sản xuất được nhiều chitinase với hiệu quả kinh tế cao. Hiện nay, có hai phương pháp lên men phổ biến nhất là lên men lỏng và lên men rắn.
Phương pháp lên men lỏng: có ưu điểm là dễ pha mơi trường lên men với độ
đồng nhất cao, có thể tiếp giống liên tục và đơn giản, dễ kiểm soát pH. Tuy nhiên, phương pháp này có nhược điểm là yêu cầu thiết bị và vận hành phức tạp, đòi hỏi nghiêm ngặt các thông số trong quá trình lên men, sử dụng nhiều năng lượng và nước, nhiều nước thải, khó xử lý khi bị tạp nhiễm và có nguy cơ phải bỏ đi hỗn hợp lên men trong một bồn lên men lớn, chi phí đầu tư thiết bị và vận hành lớn [61].
Phương pháp lên men rắn: mặc dù có một số nhược điểm là khó khăn trộn mơi trường lên men, mơi trường lên men có độ đồng nhất ko cao, khó tiếp giống và phải tiếp giống theo từng đợt, việc kiểm soát pH khá phức tạp, độ ẩm cơ chất liên tục thay đổi trong quá trình lên men, khả năng truyền nhiệt của cơ chất kém. Nhưng nó có nhiều ưu điểm quan trọng như yêu cầu thiết bị và vận hành đơn giản, có thể tận dụng các nguồn cơ chất không tan trong nước và sản phẩm phụ của nơng nghiệp với chi phí thấp (tinh bột, cellulose, lignin, pectin), bề mặt lên men rộng nên dễ trao đổi nhiệt và khơng khí, khơng địi hỏi kiểm sốt nghiêm ngặt các thơng số trong quá trình lên men, tiêu thụ ít nước và năng lượng, ít nước thải, dễ dàng kiểm soát sự tạp nhiễm, chi phí đầu tư thiết bị và vận hành rẻ [61].
Từ những ưu điểm và nhược điểm của 2 phương pháp lên men trên, phương pháp lên men rắn được coi là phương pháp phù hợp cho việc sản xuất chitinase để phối trộn với bào từ nấm và các phụ gia tạo thành chế phẩm.
Trong q trình lên men, yếu tố mơi trường ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp enzyme của nấm sợi như nguồn cơ chất, nguồn carbon và nitơ bổ sung, nhiệt độ, độ ẩm, pH, nồng độ cơ chất cảm ứng. Khảo sát các yếu tố trên nhằm chọn ra điều kiện tối ưu để nuôi cấy chủng nấm sợi nghiên cứu thu nhận chitinase có hoạt độ cao nhất.
1.6. Ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến khả năng sinh tổng hợp chitinase
1.6.1. Nguồn carbon
Cũng như nitơ, chất khoáng và nước, carbon là một trong bốn yếu tố không thể thiếu đối với mọi loài nấm cũng như vi sinh vật. Tuy nhiên, nồng độ carbon trong mơi trường q cao cũng có thể ức chế sự sinh trưởng của vi sinh vật.
Nấm sợi có khả năng đồng hóa nhiều loại carbon khác nhau, trong đó nguồn carbon có thể là các loại carbohydrate đơn giản như đường đơn, đường đôi hoặc phức tạp như tinh bột, cellulose, xylan. Nguồn carbon phức tạp này thường tồn tại ở hầu hết các sản phẩm, phế phẩm như: trấu cám, vỏ quýt, sơ dừa, lõi ngô, bột ngơ, bã mía, vỏ cà phê, mùn cưa, gạo. Những chất này thường được sử dụng làm nguồn carbon thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp chitinase. Trong trường hợp nguồn carbon là bột ngũ cốc thì ngồi khả năng cung cấp carbon, chúng còn cung cấp cả nitơ, chất khống và giữ ln vai trò làm giá thể.
Patidar và cộng sự (2005) khi nghiên cứu trên chủng nấm Penicillium
Chrysogenum PPCS1 và PPCS 2 cho thấy nguồn carbon thích hợp nhất để 2 chủng
này sinh tổng hợp chitinase là cám lên meo [58]. Parameswaran và cộng sự (2005) nghiên cứu khả năng sinh chitinase từ nấm Penicilium aculeatum NRRL 2129 đã
chỉ ra rằng hoạt tính chitinase cao nhất khi sử dụng cám mì làm nguồn carbon [56]. Nguyễn Thị Hà (2012) đã sử dụng nguồn carbon là trấu và cám để bổ sung vào môi trường sinh tổng hợp chitinase của chủng nấm Aspergillus protuberus [6].
1.6.2. Nguồn nitơ
Nguồn nitơ ảnh hưởng mạnh tới tốc độ tiết enzyme của các loài vi sinh vật. Nguồn nitơ tồn tại ở dạng vô cơ như urea, ammonium sulfate, natri nitrate và ở dạng các hợp chất hữu cơ cao phân tử như cao thịt, cao thịt bò, bột đậu tương, bột cá hay peptone. Tùy loài vi sinh vật mà nguồn nitơ được sử dụng là khác nhau. Đa số các lồi có khả năng sử dụng cả nguồn nitơ vơ cơ và hữu cơ, tuy nhiên mức độ đồng hóa từng loại nitơ để sinh enzyme lại phụ thuộc vào từng loài.
Theo Aghaeizadeh Fatemah và cộng sự (2008) khi bổ sung KNO3 vào môi trường nuôi cấy chủng Penicillium aculeatum PTCC thì hoạt tính chitinae tăng
khoảng hơn 2 lần so với môi trường cơ bản [20]. Trong khi, Nguyễn Hồng Minh và cộng sự (2013) đã chọn được NH4Cl với nồng độ 0,1% làm nguồn nitơ phù hợp để sinh tổng hợp chitinase cho chủng nấm Lecanicillium lecanii N30.8 [11].
1.6.3. Độ ẩm cơ chất
Độ ẩm khơng khí, độ ẩm vật liệu hay độ ẩm môi trường ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển và sinh sản của vi sinh vật nói chung và nấm nói riêng bởi vì tất cả cảm ứng sinh hóa ở các cơ thể sống đều diễn ra trong môi trường nước. Đa số vi sinh vật phát triển tốt ở độ ẩm >80% và độ ẩm môi trường >20%. Nếu hạ thấp độ ẩm sẽ làm rối loạn quá trình sinh lý bình thường của vi sinh vật. Độ ẩm là một trong những yếu tố làm cho vi sinh vật tiếp nhận thức ăn dễ dàng. Nhờ có độ ẩm tốt mà các chất dinh dưỡng dễ thâm nhập vào cơ thể, các hệ enzyme thủy phân mới hoạt động được. Nếu độ ẩm quá thấp xảy ra hiện tượng thay đổi trạng thái của nguyên sinh chất. Từ thay đổi trạng thái như vậy dẫn tới vi sinh vật không phát triển được [15].
Nấm Penicillium Chrysogenum PPCS2 trong nghiên cứu của Patidar và cộng sự (2005) có khả năng sinh chitinase cao nhất ở độ ẩm 120% [58]. Chủng nấm
Aspergillus protuberus trong nghiên cứu của Nguyễn Thị Hà (2012) đạt hoạt tính chitinase cao nhất với độ ẩm ban đầu 80% bổ sung vào môi trường bán rắn [6]. Trong khi đó, chủng nấm Lecanicillium lecanii N30.8 của Nguyễn Hồng Minh và
cộng sự (2013) chỉ cần 50% độ ẩm cho hoạt tính chitinase cao nhất [11].
1.6.4. Nhiệt độ nuôi cấy
Nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc tới q trình sống của vi sinh vật nói chung và của nấm mốc nói riêng. Mỗi lồi vi sinh vật thích nghi với một vùng nhiệt độ khác nhau, căn cứ vào sự thích nghi nhiệt độ, các lồi vi sinh vật được chia làm 3 nhóm là nhóm vi sinh vật ưa lạnh và chịu lạnh sinh trưởng tốt ở trong điều kiện nhiệt độ
nhóm vi sinh vật chịu nhiệt sinh trưởng tốt ở nhiệt độ cao trên 50°C. Phần lớn, nấm là vi sinh vật ưa ấm, phát triển tốt nhất ở 25-30oC. Nhiệt độ quá cao hoặc q thấp có thể kìm hãm sự sinh trưởng, thậm chí có thể giết chết sợi nấm, quá trình tổng hợp enzyme sẽ bị ức chế [4].
Ulhoa và Peberdy (1991) đã chỉ ra rằng nấm Trichoderma harzianum cho sinh chitinase cao nhất ở 28oC [73]. Trong khi đó, nghiên cứu của Nguyễn Thị Hà (2012) lại chỉ ra rằng 30oC là nhiệt độ thích hợp cho chủng nấm Aspergillus
protuberus sinh chitinase cao nhất [6]. Trong một số trường hợp đặc biệt, một số
lồi nấm vẫn có khả năng sinh tổng hợp chitinase ở nhiệt độ thấp hoặc cao hơn ngưỡng thông thường là 25-30oC. Điển hình, trong nghiên cứu của Lê Thị Huệ (2010) đã chỉ ra rằng nhiệt độ để chủng nấm Aspergillus sp. sinh chitinase cao nhất là 40oC [8].
1.6.5. pH môi trường
Giá trị pH mơi trường ban đầu có ảnh hưởng quan trọng tới sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp chitinase của các chủng nấm sợi. pH của môi trường nuôi cấy làm thay đổi hình thái sinh trưởng và bài tiết enzyme của nấm sợi. pH có ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình trao đổi chất của tế bào, do chúng ảnh hưởng đến khả năng hịa tan của các chất dinh dưỡng, hình thái màng tế bào, sự vận chuyển của các chất dinh dưỡng qua màng tế bào, hoạt độ enzyme và phản ứng oxi hóa khử [4].
Tùy thuộc vào từng loài, từng chủng mà pH mơi trường ban đầu thích hợp là acid, trung tính hay kiềm. Aspergillus protuberus sinh tổng hợp chitinase có hoạt
tính cao nhất ở điều kiện pH 5,5 [6]. Nhiều nghiên cứu trên Trichoderma harzianum chỉ ra rằng pH thích hợp cho nấm này sinh trưởng tạo chitinase có hoạt tính cao khoảng pH = 4-6 [18].
1.6.6. Cơ chất
Chitinase có thể là enzyme cảm ứng hoặc enzyme cấu trúc. Tuy nhiên trong các môi trường nuôi cấy vi sinh vật người ta đều bổ sung thêm cơ chất chitin nhằm
tăng khả năng tạo chitinase. Nhìn chung sự hiện diện của chitin trong mơi trường ni cấy hữu ích cho việc tạo chitinase [50]. Trong số các cơ chất, chitin huyền phù có khả năng kích thích tạo chitinase cao nhất.
Theo Nguyễn Thị Hà (2012), chủng nấm Aspergillus protuberus sinh tổng
hợp chitinase cao nhất khi bổ sung 15% cơ chất cảm ứng chitin vào môi trường lên men bán rắn [6]. Trong khi chủng Trichoderma hurziunum trong nghiên cứu của
Ulhoa và Peberdy (1991) chỉ cần bổ sung vào môi trường nuôi cấy 0,5% cơ chất cảm ứng chitin đã cho hoạt tính chitinase cao nhất [71].
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị sử dụng 2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị sử dụng
2.1.1. Nguyên liệu
Mẫu đất được lấy trên bề mặt và xác rệp chết bởi nấm gây bệnh trên đồng ruộng được thu thập ở cánh đồng mía phường Đồng Mai, quận Hà Đơng, Hà Nội. Các mẫu sau khi thu thập được chúng tơi bảo quản tại phịng Cơng nghệ sinh học môi trường, Viện Công nghệ sinh học, Viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Thử nghiệm sinh học: Rệp muội hại cây ngô được thu thập từ cánh đồng ngô
ở bãi bồi sơng Hồng, Hà Nội đem về phịng thí nghiệm nhân giống. Dựa vào đặc điểm hình thái và cây chủ, rệp này bước đầu được nhận định thuộc loài Aphis maydis.
2.1.2. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
Các hóa chất sử dụng đều là hóa chất ngoại nhập của các hãng Sigma, Merk, Invitrogen, Prolab, ICN…
Một số vật liệu cần thiết khác như: khoai tây, lá ngô, gạo, cám gạo, bột ngô, lõi ngô được mua và thu thập tại khu vực Hà Nội.
Chuẩn bị chitin huyền phù 1%: 1g bột chitin được thêm từ từ vào 20 ml dung
dịch HCl đậm đặc, khuấy đều và ủ trong 8 giờ. Thêm vào hỗn hợp 200 ml ethanol lạnh (-20oC) và để qua đêm. Ly tâm hỗn hợp ở 4000 vòng/phút, trong 20 phút, thu lấy kết tủa và rửa bằng đệm phosphate 0,05 M cho đến khi đạt pH trung tính thì dừng lại. Thêm vào tủa 100 ml dung dịch đệm trên cho đến khi thể tích đạt 100 ml.
Thuốc thử DNS (3,5-Dinitrosalicylic acid): Cân 5 g DNS bổ sung thêm 300
ml nước cất, đun từ từ đến khoảng 50o
C. Tiếp tục bổ sung 8 g NaOH, khuấy đều, cho thêm 150 g muối Tartrate (Sodium potassium tartrate- KNaC4H4O6). Bổ sung từ từ nước cất cho đến thể tích 500 ml. Đun dần cho đến 100oC, lắc đều cho đến khi các hóa chất tan hết.
2.1.3. Thiết bị
Trong quá trình nghiên cứu, các thiết bị, máy móc đã được sử dụng có độ chính xác cao tại phịng Cơng nghệ sinh học mơi trường, phịng Các chất chức năng sinh học và phịng thí nghiệm trọng điểm Quốc gia về công nghệ Gene- Viện Công nghệ sinh học, viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Bảng 2.1. Danh mục các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm
Tên thiết bị Xuất xứ
Cân OHAUS PA213 Mỹ
Máy đo pH HANA HI 2211 PH/ORP Meter Ý
Máy đo UV-VIS 752N, Trung Quốc
AB applied Biosystems, Gene Amp PCR system 2700, Singapore
Khuấy từ gia nhiệt AHY Trung Quốc
Bể ổn nhiệt BUCHI Thụy Sỹ
Nồi khử trùng HVE-50 Nhật Bản