CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.4. Xác định trình tự gene mã hóa18S rRNA của chủng NM4
Hiện nay, phương pháp sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu phân loại dựa vào trình tự đoạn gene mã hóa 18S rRNA được sử dụng rất rộng rãi và kết quả phản ánh nhanh chóng và chính xác vị trí phân loại của các chủng nấm sợi. Do đó chúng tơi tiến hành tách dòng gene mã hóa 18S rRNA của chủng nấm NM4 để xác định và so sánh trình tự nucleotide của chủng nấm này với các chủng nấm khác trên ngân hàng gen thế giới nhằm phân loại định tên chủng này.
3.4.1. Tách chiết DNA tổng số của chủng nấm NM4
Trong phân loại phân tử, việc tách chiết được DNA tổng số nguyên vẹn không bị đứt gãy và ở dạng tinh sạch không bị lẫn các thành phần của tế bào như proteins, polysaccharides… là rất quan trọng vì chất lượng của DNA sẽ ảnh hưởng đến các thí nghiệm tiếp theo. DNA tổng số của nấm NM4 được tách chiết theo mô tả ở phần phương pháp mục 2.2.6.
DNA tổng số sau khi tách được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%, phổ điện di thu được thể hiện trên hình 3.5.
Hình 3.5. DNA tổng số của chủng nấm NM4
Kết quả điện di đồ cho thấy, DNA tổng số của chủng NM4 có độ tinh sạch cao, hàm lượng đủ lớn, băng gọn không đứt gãy, đủ điều kiện để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
3.4.2. Nhân đoạn gene 18S rRNA của chủng NM4
Sử dụng DNA tổng số làm khuôn, cặp mồi đặc hiệu và chu trình nhiệt cho chủng nấm NM4 như đã mô tả ở phần phương pháp mục 2.2.6, sản phẩm PCR thu được là một băng duy nhất, sắc nét và có kích thước khoảng 550 bp đúng theo tính tốn lý thuyết (hình 3.6).
Hình 3.6. Điện di đồ sản phẩm nhân đoạn gene mã hóa 18S rRNA của chủng NM4
M: Marker 100 bp; NM4: Sản phẩm PCR của chủng NM4
Sản phẩm PCR của chủng nấm này được tinh sạch bằng bộ kit AccuPrep PCR Purification theo quy trình của nhà sản xuất đã nêu ở mục 2.2.6 và gửi đọc trình tự trên máy xác định trình tự tự động.
Trình tự đoạn gene mã hóa 18S rRNA của chủng NM4 đã được xác định trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100. Sau khi phân tích và xử lý số liệu, trình tự đoạn gene mã hóa18S rRNA của chủng NM4 được trình bày ở hình 3.7.
M NM4
550 bp 500 bp
Hình 3.7. Trình tự đoạn gene 18S rRNA của chủng nấm NM4
Dựa vào việc so sánh trình tự đoạn gene mã hóa18S rRNA của chủng NM4 với trình tự của các vi sinh vật eukaryota khác được công bố trên GeneBank, chúng tôi đã xây dựng được cây phát sinh chủng loại của chủng NM4 như sau:
(Thước đo thể hiện 1 nucleotide khác nhau trên 100 nucleotide so sánh)
Hình 3.8. Cây phát sinh chủng loại của chủng nấm NM4.
Quan sát trên hình 3.8, chúng tơi nhận thấy, chủng nấm NM4 có quan hệ gần gũi với các chủng thuộc chi Penicillium. Trình tự gene đầy đủ của chủng NM4
(khoảng 550 bp) có độ tương đồng cao với các chủng Penicillium commune IBT
15141 (tương đồng 100%), chủng Penicillium chrysogenum CBS 306.48 (tương
đồng 99%). Do đó, chúng tơi tạm đặt tên chủng nấm này là Penicillium sp. M4.
gi|358001599|gb|JN938963.1| gi|358001612|gb|JN938976.1| gi|358001338|gb|JN939245.1| gi|358001682|gb|JN939046.1| gi|224812793|gb|FJ717700.1| gi|358001316|gb|JN939223.1| gi|309751842|gb|GU561988.1| gi|M4 gi|33334403|gb|AF548089.1| gi|323371160|gb|GU733359.1| gi|373938716|gb|JN642222.1| BTL12 Bacillus gi|47778606|gb|AY608605.1| gi|21912394|emb|AJ419629.1| gi|7209536|dbj|AB021189.1| gi|209779036|gb|AY793550.3| gi|27543888|dbj|AB073199.1| gi|27543877|dbj|AB073188.1| gi|27543885|dbj|AB073196.1| 85 100 100 100 45 61 0.01
Penicillium glabrum DAOM 221136 (JN938963) Penicillium verrucosum DAOM 221128 JN938976) Penicillium tricolor CBS 101488 (JN939245) Penicillium crustosum DAOM 215345(JN939046) Penicillium spinulosum (FJ717700)
Penicillium melanoconidium CBS 109605 (JN939223) Penicillium expansum SK16 (GU561988)
Penicillium sp. M4 (JX145346)
Penicillium commune IBT 15141 (AF548089) Penicillium chrysogenum CBS 306.48 (GU733359) Penicillium solitum 20-01 (JN642222)
Chủng nấm này được đăng ký trên ngân hàng Genbank (NCBI) với mã số JX145346.
Sau quá trình phân loại cho thấy, chủng nấm Penicillium sp. M4 khơng thuộc nhóm vi sinh vật gây bệnh trên người, nhiều chủng thuộc chi này được sử dụng trong sản xuất phomat, thịt chua như chủng nấm Penicillium camemberti, Penicillium roqueforti hoặc chủng nấm Penicillium nalgiovense trong sản xuất đồ
tráng miệng [45]. Đặc biệt chủng nấm Penicillium chrysogenum còn được sản xuất kháng sinh penicillin sử dụng cho con người [66]. Với mục đích sử dụng chủng Penicillium sp. M4 trong tạo chế phẩm phòng trừ rệp muội bảo vệ cây trồng, hiệu
quả diệt rệp của chủng nấm phụ thuộc rất nhiều vào hoạt lực chitinase của chủng nấm, do đó trong các nghiên cứu tiếp theo chủng tơi đã nghiên cứu các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp và hoạt động của chitinase của chủng nấm Penicillium sp. M4 để có những tác động bổ sung thích hợp trong q trình tạo chế phẩm về sau trong việc nâng cao hiệu quả tiêu diệt rệp muội sau này.