2.2.2 .Sàng lọc chủng nấm ký sinh cơn trùng có độc lực diệt rệp hại ngô cao
2.2.7. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường lên khả năng sinh
tổng hợp chitinase của chủng nấm được lựa chọn
Chủng nấm được nuôi trên môi trường PDA ở 30oC trong vịng 7 ngày. Sau đó, một miếng nấm trên đĩa thạch (1×1 cm) được cấy vào bình nón chứa 100 ml môi trường PDB và được ni lắc 150 vịng/ phút ở 30oC. Sau 4 ngày, dịch ni có
mật độ bào tử 5.108/ml được cấy vào các bình nón 250 ml chứa cơ chất theo tỉ lệ 1 ml/10 g cơ chất.
Sau khi lên men 7 ngày ở 30oC trong điều kiện tĩnh, dịch enzyme được chiết tách bằng nước cất (90 ml) trên máy lắc trong vòng 2 giờ (200 vòng/phút) lọc qua vải màn thu dịch lọc. Đem dịch lọc ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi là dịch enzyme thơ. Sau đó, tiến hành xác định hoạt tính chitinase như mô tả trong phần phương pháp 2.2.4. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần đo. Kết quả được xử lý bằng phần mềm Microsoft office excel.
Ảnh hưởng của nguồn cơ chất: Mười nguồn cơ chất khác nhau đã được
khảo sát: lõi ngô, gạo, cám gạo, bột ngô, hỗn hợp: cám gạo/bột ngô, bột ngô/lõi ngô, gạo/bột ngô, cám gạo/gạo, cám gạo/lõi ngô, gạo/lõi ngô (1:1, w/w). Khối lượng cơ chất là 10 g/bình và các loại môi trường được bổ sung lượng nước tương ứng là 8, 5, 8, 5, 10, 10, 8, 10, 10, 10 ml/bình, cùng với 1% chitin làm cơ chất cảm ứng.
Ảnh hưởng của độ dày cơ chất: khả năng sinh tổng hợp chitinase của
chủng nấm được khảo sát ở các độ dày cơ chất: 6; 9; 11; 13,5; 15; 17; 19; 21; 23 và 25 mm (tương đương với 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 g/bình). Bổ sung 50% độ ẩm so với cơ chất bột ngô và 1% chitin làm cơ chất cảm ứng.
Ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất: Chủng nấm được nuôi trên 16 g cơ chất bột
ngơ có bổ sung 1% chitin làm cơ chất cảm ứng và nước được bổ sung theo các tỉ lệ: 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% (v/w) để dánh giá ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất lên khả năng sinh tổng hợp chitinase của chủng nấm.
Ảnh hưởng của nguồn cơ chất cảm ứng: Chủng nấm được nuôi trên 16 g
cơ chất bột ngô, 60% độ ẩm và bổ sung cơ chất cảm ứng chitin ở các nồng độ: 0%; 0,5%; 1%; 1,5%; 2%; 2,5% (w/w).
Ảnh hưởng của nhiệt độ: Khả năng sinh tổng hợp chitinase của chủng nấm
được khảo sát ở các nhiệt độ khác nhau: 20, 26, 28, 30, 37 và 40o
chất bột ngơ trong mỗi bình, bổ sung 1% chitin làm cơ chất cảm ứng và 60% độ ẩm (v/w).
Ảnh hưởng của pH môi trường: Chủng nấm được lên men ở các điều kiện
tối ưu như trên nhưng thay độ ẩm bằng các hệ đệm với dải pH từ 3-10 như: (i) 0,05M sodium citrate pH 3-6; (ii) 0,05M sodium phosphate pH 7,8; (iii) 0,05M glycine-NaOH pH 9,10.
Ảnh hưởng của một số nguồn nitơ vô cơ: Chủng nấm được lên men ở các
điều kiện tối ưu như trên và bổ sung 0,5% (w/w) các nguồn nitơ vô cơ như: (NH4)2SO4, NH4NO3, (NH4)2HPO4, urê, KNO3, NaNO3.
Sau khi xác định được nguồn nitơ vô cơ tốt nhất, để tối ưu nồng độ nitơ vô cơ chủng nấm được tối ưu trong mơi trường có nồng độ nitơ vơ cơ tương ứng là: 0,1%; 0,3%; 0,5%; 0,7%; 0,9%; 1% (w/w).
Ảnh hưởng của thời gian lên men: Chủng nấm được lên men ở các điều
kiện đã tối ưu (30oC; pH 6; 1% chitin làm cơ chất cảm ứng; 16 g cơ chất bột ngô; độ ẩm 60%; 0,9% urê). Dịch enzyme được thu ở những khoảng thời gian khác nhau: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12 ngày để xác định hoạt tính.