2.2.2 .Sàng lọc chủng nấm ký sinh cơn trùng có độc lực diệt rệp hại ngô cao
2.2.3. Chọn lọc chủng nấm ký sinh cơn trùng có hoạt tính chitinase cao
Nguyên tắc
Khi chitinase có mặt trong mơi trường chứa chitin nó sẽ phân giải chitin thành N-acetyl-D-glucosamine và các cấu trúc mạch ngắn hơn không bắt màu với thuốc thử lugol. Khi tác dụng với thuốc thử lugol, độ lớn của phần môi trường trong suốt (vịng phân giải) phản ánh hoạt tính chitinase của chủng nấm. Đo đường kính vịng phân giải để xác định hoạt tính chitinase.
Cách tiến hành
Đĩa thạch chứa 0,5% cơ chất chitin dày khoảng 0,5 cm được đục lỗ với đường kính 0,5 cm. Một trăm microlit dịch enzyme được cho vào lỗ rồi ủ 12 giờ trong 4oC cho enzyme khuếch tán. Sau đó, đĩa thạch được ủ qua đêm ở 37oC lấy ra và nhuộm bằng lugol 1%. Bán kính vịng thủy phân Rhalo= R-r (với R là bán kính vịng ngồi tính từ tâm lỗ đến mép ngồi cùng vịng thủy phân và r là bán kính lỗ), biểu hiện hoạt tính tương đối của enzyme.
2.2.4. Xác định hoạt tính chitinase của chủng nấm ký sinh cơn trùng
Nguyên tắc
Hoạt tính chitinase được xác định dựa vào lượng đường khử N-acetyl-β-D- glucosamine sinh ra trong phản ứng thủy phân. Khi cho chitinase tác dụng với cơ chất là chitin huyền phù, N-acetyl-β-D-glucosamine sinh ra trong phản ứng được định lượng qua phản ứng với thuốc thử DNS (3,5-dinitrosalisylic acid), cho sản phẩm 3-amino-5 nitrosalicylic acid hấp thụ ánh sáng khả kiến ở bước sóng 540 nm.
Xây dựng đường chuẩn
Chuẩn bị dung dịch N-acetyl-β-D-glucosamine chuẩn 10 μmol/ml: cân chính xác 0,0221g N-acetyl-β-D-lucosgamine, cho nước cất vào đủ 10 ml.
Từ dung dịch N-acetyl-β-D-glucosamine chuẩn (10 μmol/ml) ra các nồng độ chuẩn khác nhau từ 0-10 µmol/ml. Sau đó, bổ sung 100 µl dung dịch DNS vào các ống thí nghiệm để được tỷ lệ 1:1 (100 µl dung dịch chuẩn: 100 µl DNS). Hỗn hợp được lắc đều, đun cách thủy ở 100oC trong 5 phút. Để nguội, thêm 1800 ml nước cất vào mỗi ống để đạt thể tích 2 ml/ống, hệ số pha lỗng là 20 lần. Lắc đều và đo OD ở bước sóng 540 nm bằng máy đo quang phổ. Từ các kết quả đo được, ta lập được đường chuẩn N-acetyl-β-D-glucosamine như hình 2.1.
y = 0.083x - 0.009 R² = 0.997 -0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 0 2 4 6 8 10 12 OD 540n m N- acetyl-β-D-glucosamine (µmol/ml)
Cách xác định hoạt tính chitinase
Dịch enzyme được chiết tách bằng nước cất (90 ml) trên máy lắc trong vòng 2 giờ (200 vòng/phút) lọc qua vải màn thu dịch lọc. Đem dịch lọc ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi là dịch enzyme thơ.
Ống thí nghiệm: 50 µl dịch enzyme thơ + 50 µl chitin huyền phù 1%. Hỗn hợp được lắc đều và ủ ở 40oC trong vịng 120 phút thì bổ sung 100 µl DNS. Hỗn hợp được lắc đều rồi đun cách thủy ở 100oC trong vòng 5 phút. Sau đó để nguội, pha lỗng đến 1 ml và đo OD ở bước sóng 540 nm bằng máy đo quang phổ .
Ống đối chứng: 50 µl dịch enzyme thơ + 100 µl DNS, lắc đều, sau đó mới thêm 50 µl chitin huyền phù 1% và tiếp tục làm như trên.
Lượng glucosamine sinh ra được xác định dựa theo đường chuẩn N-acetyl-β- D-glucosamine. Một đơn vị hoạt tính chitinase là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1 μmol N-acetyl-β-D-glucosamine (NAG) từ chitin huyền phù trong thời gian 1 phút ở nhiệt độ phản ứng 40oC [34].
Tổng hoạt tính (U/ml) =
Trong đó, a: nồng độ glucosamine (µmol/ml), b: Hệ số pha lỗng của dung dịch enzyme, V: thể tích của hỗn hợp phản ứng (ml), 120: thời gian phản ứng (phút).
Kết quả sau đó được xử lý bằng phần mềm Microsoft office excel và phần mềm thống kê SAS.
2.2.5. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng nấm có độc lực diệt rệp hại ngơ cao hại ngô cao
Chủng nấm được nuôi cấy trên môi trường PDA có bổ sung kháng sinh. Hình thái khuẩn lạc và hình thái bào tử được quan sát sau 5 ngày ni cấy. Hình thái bào tử của chủng nấm được quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi quang học (Nikon eclipse 50i, Nhật Bản) với độ phóng đại 40 lần.
2.2.6. Phương pháp phân loại nấm sợi dựa vào xác định và so sánh trình tự gen mã hóa 18S rRNA mã hóa 18S rRNA
Tách DNA tổng số của chủng nấm
Màng tế bào được phá bằng lysozym và SDS, DNA tổng số được giải phóng ra. Việc loại bỏ protein khỏi DNA được thực hiện bởi enzym proteinaza K. Quy trình các bước thực hiện như sau:
Bước 1: Nuôi cấy thu sinh khối nấm
Bước 2: Thu sinh khối bằng cách ly tâm 6000 vòng/10 phút ở 4oC. Lặp lại vài lần để thu đủ mẫu.
Bước 3: Bổ sung môi trường nuôi cấy để rửa sinh khối, ly tâm 2 lần với 6000 vòng/10 phút ở 4oC.
Bước 4: Dùng panh để lấy sinh khối cho vào cối sứ đã khử trùng và nghiền trong nitơ lỏng thành bột mịn.
Bước 5: Dùng thìa xúc mẫu cho vào các ependoff, bổ sung 600 µl đệm lyzozym và lắc nhẹ.
Bước 6: Bổ sung tiếp 65 µl lysozym, ủ 37oC trong 30-45 phút. Bước 7: Cho 50 µl protenaza K ủ ở 56oC trong 2 giờ.
Bước 8: Bổ sung tiếp chloroform : isoamyalcolhol (tỷ lệ 24 : 1)với tỷ lệ 1 : 1 về thể tích, trộn đều sau đó ly tâm 12000 vịng/phút trong 15 phút ở 4oC.
Bước 9: Thu phần dịch nổi bên trên cho vào ống Eppendorf mới.
Bước 10: Bổ sung isopropanol với tỷ lệ 1:1 về thể tích, ủ ở 4oC qua đêm. Bước 11: Ly tâm ở vận tốc 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC, thu tủa. Bước 12: Hòa tan kết tủa trong 500 µl TE.
Bước 14: Bổ sung chloroform : isomyalcolhol (tỷ lệ 24:1) với tỷ lệ 1:1 về thể tích sau đó đảo nhẹ và ly tâm ở vận tốc 12000 vòng/phút, 15 phút ở 4oC.
Bước 15: Thu phần dịch nổi phía trên.
Bước 16: Bổ sung ethanol 100% (giữ lạnh) tỷ lệ 1:1 về thể tích.
Bước 17: Ly tâm ở vận tốc 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC, thu kết tủa sau đó rửa sạch bằng ethanol 80%. Làm khơ DNA.
Bước 18: Hịa trong 100µl TE và bảo quản ở 4o C. Nhân đoạn gene 18S rRNA bằng kỹ thuật PCR
Đoạn gen mã hoá 18S rRNA được nhân lên bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi:
Mồi xuôi EF4f: 5’ – GGAAGGG(G/A)TGTATTTATTAG – 3’ Mồi ngược Fung5R: 5’ – GTAAAGTCCTGGTTCCC – 3’ Thành phần phản ứng cho tổng thể tích phản ứng là 25 µl bao gồm: Buffer Taq 10x MgCl2 25mM dNTPs 2,5mM DNA khuôn : 2,5 µl : 3 µl : 2,5 µl : 2 µl EF4f (20µM) Fung5R (20µM) Taq (5Unit/µl) dH2O : 1 µl : 1 µl : 0,5 µl : 12,5 µl
Chu trình nhiệt được sử dụng như sau:
94oC 94oC 5 phút phut phút 1 phút 48oC 1 phút 72oC 72oC 1 phút 7 phút ∞ 32 chu kì 4oC
Sản phẩm PCR được tinh sạch theo quy trình hướng dẫn của bộ kit AccuPrep PCR Purrification Kit (hãng Bioneer), cụ thể:
Bước 1: Bổ sung 5 lần thể tích của sản phẩm PCR bằng buffer 1 (PCR Binding Buffer). Hịa tan cho tới khi tan hồn tồn.
Bước 2: Chuyển hỗn hợp sang tube chứa cột DNA binding và ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút.
Bước 3: Bỏ dịch và bổ sung 500 µl Buffer 2 vào tube chứa cột DNA binding và ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút.
Bước 4: Bỏ dịch và lặp lại bước 3.
Bước 5: Làm khô cột chứa DNA binding bằng cách ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút.
Bước 6: Bổ sung Buffer 3 vào giữa cột và đợi 1 phút tại nhiệt độ phòng. Bước 7: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Bỏ cột, thu dịch. Bảo quản mẫu ở 4oC ta được sản phẩm PCR đã được tinh sạch.
Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch, được điện di kiểm tra lại và được gửi xác định trình tự trên máy xác định trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Data Collection v.1.0 và so sánh với các trình tự trên GenBank.
Cây phát sinh chủng loại đoạn gen mã hóa 16S rRNA của các chủng vi khuẩn và các chủng đại diện được xây dựng dựa trên chương trình Blast, các phần mềm Bioedit, Clustal X và Mega4.
2.2.7. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường lên khả năng sinh tổng hợp chitinase của chủng nấm được lựa chọn tổng hợp chitinase của chủng nấm được lựa chọn
Chủng nấm được nuôi trên môi trường PDA ở 30oC trong vịng 7 ngày. Sau đó, một miếng nấm trên đĩa thạch (1×1 cm) được cấy vào bình nón chứa 100 ml môi trường PDB và được ni lắc 150 vịng/ phút ở 30oC. Sau 4 ngày, dịch ni có
mật độ bào tử 5.108/ml được cấy vào các bình nón 250 ml chứa cơ chất theo tỉ lệ 1 ml/10 g cơ chất.
Sau khi lên men 7 ngày ở 30oC trong điều kiện tĩnh, dịch enzyme được chiết tách bằng nước cất (90 ml) trên máy lắc trong vòng 2 giờ (200 vòng/phút) lọc qua vải màn thu dịch lọc. Đem dịch lọc ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi là dịch enzyme thơ. Sau đó, tiến hành xác định hoạt tính chitinase như mô tả trong phần phương pháp 2.2.4. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần đo. Kết quả được xử lý bằng phần mềm Microsoft office excel.
Ảnh hưởng của nguồn cơ chất: Mười nguồn cơ chất khác nhau đã được
khảo sát: lõi ngô, gạo, cám gạo, bột ngô, hỗn hợp: cám gạo/bột ngô, bột ngô/lõi ngô, gạo/bột ngô, cám gạo/gạo, cám gạo/lõi ngô, gạo/lõi ngô (1:1, w/w). Khối lượng cơ chất là 10 g/bình và các loại môi trường được bổ sung lượng nước tương ứng là 8, 5, 8, 5, 10, 10, 8, 10, 10, 10 ml/bình, cùng với 1% chitin làm cơ chất cảm ứng.
Ảnh hưởng của độ dày cơ chất: khả năng sinh tổng hợp chitinase của
chủng nấm được khảo sát ở các độ dày cơ chất: 6; 9; 11; 13,5; 15; 17; 19; 21; 23 và 25 mm (tương đương với 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 g/bình). Bổ sung 50% độ ẩm so với cơ chất bột ngô và 1% chitin làm cơ chất cảm ứng.
Ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất: Chủng nấm được nuôi trên 16 g cơ chất bột
ngơ có bổ sung 1% chitin làm cơ chất cảm ứng và nước được bổ sung theo các tỉ lệ: 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% (v/w) để dánh giá ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất lên khả năng sinh tổng hợp chitinase của chủng nấm.
Ảnh hưởng của nguồn cơ chất cảm ứng: Chủng nấm được nuôi trên 16 g
cơ chất bột ngô, 60% độ ẩm và bổ sung cơ chất cảm ứng chitin ở các nồng độ: 0%; 0,5%; 1%; 1,5%; 2%; 2,5% (w/w).
Ảnh hưởng của nhiệt độ: Khả năng sinh tổng hợp chitinase của chủng nấm
được khảo sát ở các nhiệt độ khác nhau: 20, 26, 28, 30, 37 và 40o
chất bột ngơ trong mỗi bình, bổ sung 1% chitin làm cơ chất cảm ứng và 60% độ ẩm (v/w).
Ảnh hưởng của pH môi trường: Chủng nấm được lên men ở các điều kiện
tối ưu như trên nhưng thay độ ẩm bằng các hệ đệm với dải pH từ 3-10 như: (i) 0,05M sodium citrate pH 3-6; (ii) 0,05M sodium phosphate pH 7,8; (iii) 0,05M glycine-NaOH pH 9,10.
Ảnh hưởng của một số nguồn nitơ vô cơ: Chủng nấm được lên men ở các
điều kiện tối ưu như trên và bổ sung 0,5% (w/w) các nguồn nitơ vô cơ như: (NH4)2SO4, NH4NO3, (NH4)2HPO4, urê, KNO3, NaNO3.
Sau khi xác định được nguồn nitơ vô cơ tốt nhất, để tối ưu nồng độ nitơ vô cơ chủng nấm được tối ưu trong mơi trường có nồng độ nitơ vơ cơ tương ứng là: 0,1%; 0,3%; 0,5%; 0,7%; 0,9%; 1% (w/w).
Ảnh hưởng của thời gian lên men: Chủng nấm được lên men ở các điều
kiện đã tối ưu (30oC; pH 6; 1% chitin làm cơ chất cảm ứng; 16 g cơ chất bột ngô; độ ẩm 60%; 0,9% urê). Dịch enzyme được thu ở những khoảng thời gian khác nhau: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12 ngày để xác định hoạt tính.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập, tuyển chọn chủng nấm ký sinh cơn trùng có độc lực diệt rệp muội hại ngô cao. muội hại ngô cao.
Từ các nguồn mẫu khác nhau: mẫu đất, xác rệp chết bởi nấm, chúng tôi đã phân lập được 6 chủng nấm có khả năng phát triển trên mơi trường PDA có bổ sung các loại kháng sinh cần thiết. Các chủng nấm được tách sạch riêng từng chủng và tiến hành quan sát hình thái khuẩn lạc được thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Các chủng nấm phân lập được trên môi trường PDA
Tên mẫu Tên chủng Hình thái khuẩn lạc trên mơi trường PDA
Mẫu đất
NM1 Khuẩn lạc tròn, khuẩn ty khí sinh màu trắng, nhân màu cam, bông, xốp, D: 2,5 - 3 cm
NM2 Khuẩn lạc tròn, bề mặt khuẩn ty khí sinh chắc, màu trắng, viền màu nâu, ăn sâu vào thạch, D:2- 2,5 cm NM3 Khuẩn lạc tròn, khuẩn ty khí sinh màu nâu, viền màu
trắng, bông, xốp, D: 2,7- 3 cm
NM6 Khuẩn lạc trịn, khuẩn ty khí sinh màu cam, bơng, xốp, D: 3-3,5 cm
Mẫu xác rệp chết bởi nấm
NM4 Khuẩn lạc trắng, khuẩn ty khí màu trắng, bông, xốp, D: 2,5- 3 cm
NM5 Khuẩn lạc mọc lan rộng, khuẩn ty khí sinh màu xanh rêu, bông, xốp.
Trên thế giới hiện nay, có rất nhiều phương pháp khác nhau để tạo ra chủng có hoạt tính sinh học ổn định và hiệu lực diệt cơn trùng cao, phục vụ cho mục đích sản xuất chế phẩm sinh học. Đó là ni cấy nấm trên mơi trường có nguồn dinh dưỡng đặc biệt hoặc đột biến chọn lọc chủng bằng hóa chất [41, 52], bằng chiếu tia tử ngoại UV [51] và bằng phương pháp sinh học phân tử [2]. Nhưng phương pháp
đơn giản nhất mà nhiều tác giả trên thế giới đã áp dụng và rất thành công là thử trực tiếp trên hàng loạt đối tượng cơn trùng để tìm phổ tác dụng của nấm [48, 67]. Trên cơ sở đó, chúng tơi đã sử dụng phương pháp thử trực tiếp trên đối tượng côn trùng để đánh giá độc lực diệt rệp của các chủng nấm phân lập được.
Mỗi chủng nấm có độc lực khác nhau đối với từng loài rệp và trong từng điều kiện môi trường khác nhau. Do điều kiện tự nhiên trên đồng ruộng và nhà lưới, nhiệt độ và độ ẩm luôn thay đổi. Nấm diệt côn trùng sinh trưởng và phát triển tốt, thể hiện độc tính diệt cơn trùng mạnh và thích nghi ở dải rộng của nhiệt độ và độ ẩm là rất quan trọng. Dựa vào đặc điểm sinh trưởng của các chủng nấm cũng như rệp ngô, chúng tôi đã chọn nhiệt độ 30oC và độ ẩm khơng khí 70% để thử nghiệm khả năng diệt rệp ngô của 6 chủng nấm phân lập được.
Dịch bào tử của 6 chủng nấm được phun lên rệp ngơ ở 30oC và độ ẩm khơng khí 70%, số lượng rệp ngô sống sót được theo dõi sau 7 ngày phun. Kết quả cho thấy, tỉ lệ rệp chết tăng lên từ ngày thứ 2 sau khi phun, ngày thứ 3 trên xác rệp chết bị bao phủ bởi các sợi nấm (hình 3.1) và đến ngày thứ 7 tỷ lệ rệp chết cao nhất.
(A) (B) (C)
Hình 3.1. Kết quả phun bào tử nấm lên rệp ngô
A. Mẫu đối chứng; B: mẫu phun bào tử nấm; C: Rệp bị chết bởi nấm được chụp qua kính hiển vi quang học với độ phóng đại 20 lần.
Sau 3 ngày phun, hai chủng NM3 và NM4 có độc lực diệt rệp khá cao trên 50%, cịn 4 chủng cịn lại có độc lực diệt rệp thấp. Sau ngày thứ 7 kết quả cho thấy,
là chủng NM3 với 88,4 ± 2,6% rệp bị diệt. Còn lại 4 chủng nấm là NM1, NM2, NM5, NM6 hiệu lực diệt rệp thấp chỉ đạt từ 39,3 - 49,9%, kết quả được thể hiện ở hình 3.2 và bảng phụ lục 1.
Hình 3.2. Độc lực diệt rệp của 6 chủng nấm
Ghi chú: Control: mẫu phun Tween 80
NM1-NM4: mẫu phun bào tử nấm của các chủng nấm ký sinh côn trùng tương ứng NM1-NM4.
Hiện nay, trên thế giới cũng như trong nước có rất ít nghiên cứu về khả năng diệt rệp muội hại ngô của các chủng nấm ký sinh côn trùng. Trong nghiên cứu của Quyền Đình Thi và cộng sự (2012), 3 chủng nấm Lecanicillium lecanii: L43, Le85 và L387 diệt được 100% rệp sau 7 ngày phun với nồng độ bào tử 108/ml trong điều