2.2.2 .Sàng lọc chủng nấm ký sinh cơn trùng có độc lực diệt rệp hại ngô cao
2.2.6. Phương pháp phân loại nấm sợi dựa vào xác định và so sánh trình tự gen
Tách DNA tổng số của chủng nấm
Màng tế bào được phá bằng lysozym và SDS, DNA tổng số được giải phóng ra. Việc loại bỏ protein khỏi DNA được thực hiện bởi enzym proteinaza K. Quy trình các bước thực hiện như sau:
Bước 1: Nuôi cấy thu sinh khối nấm
Bước 2: Thu sinh khối bằng cách ly tâm 6000 vòng/10 phút ở 4oC. Lặp lại vài lần để thu đủ mẫu.
Bước 3: Bổ sung môi trường nuôi cấy để rửa sinh khối, ly tâm 2 lần với 6000 vòng/10 phút ở 4oC.
Bước 4: Dùng panh để lấy sinh khối cho vào cối sứ đã khử trùng và nghiền trong nitơ lỏng thành bột mịn.
Bước 5: Dùng thìa xúc mẫu cho vào các ependoff, bổ sung 600 µl đệm lyzozym và lắc nhẹ.
Bước 6: Bổ sung tiếp 65 µl lysozym, ủ 37oC trong 30-45 phút. Bước 7: Cho 50 µl protenaza K ủ ở 56oC trong 2 giờ.
Bước 8: Bổ sung tiếp chloroform : isoamyalcolhol (tỷ lệ 24 : 1)với tỷ lệ 1 : 1 về thể tích, trộn đều sau đó ly tâm 12000 vịng/phút trong 15 phút ở 4oC.
Bước 9: Thu phần dịch nổi bên trên cho vào ống Eppendorf mới.
Bước 10: Bổ sung isopropanol với tỷ lệ 1:1 về thể tích, ủ ở 4oC qua đêm. Bước 11: Ly tâm ở vận tốc 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC, thu tủa. Bước 12: Hịa tan kết tủa trong 500 µl TE.
Bước 14: Bổ sung chloroform : isomyalcolhol (tỷ lệ 24:1) với tỷ lệ 1:1 về thể tích sau đó đảo nhẹ và ly tâm ở vận tốc 12000 vòng/phút, 15 phút ở 4oC.
Bước 15: Thu phần dịch nổi phía trên.
Bước 16: Bổ sung ethanol 100% (giữ lạnh) tỷ lệ 1:1 về thể tích.
Bước 17: Ly tâm ở vận tốc 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC, thu kết tủa sau đó rửa sạch bằng ethanol 80%. Làm khơ DNA.
Bước 18: Hịa trong 100µl TE và bảo quản ở 4o C. Nhân đoạn gene 18S rRNA bằng kỹ thuật PCR
Đoạn gen mã hoá 18S rRNA được nhân lên bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi:
Mồi xuôi EF4f: 5’ – GGAAGGG(G/A)TGTATTTATTAG – 3’ Mồi ngược Fung5R: 5’ – GTAAAGTCCTGGTTCCC – 3’ Thành phần phản ứng cho tổng thể tích phản ứng là 25 µl bao gồm: Buffer Taq 10x MgCl2 25mM dNTPs 2,5mM DNA khn : 2,5 µl : 3 µl : 2,5 µl : 2 µl EF4f (20µM) Fung5R (20µM) Taq (5Unit/µl) dH2O : 1 µl : 1 µl : 0,5 µl : 12,5 µl
Chu trình nhiệt được sử dụng như sau:
94oC 94oC 5 phút phut phút 1 phút 48oC 1 phút 72oC 72oC 1 phút 7 phút ∞ 32 chu kì 4oC
Sản phẩm PCR được tinh sạch theo quy trình hướng dẫn của bộ kit AccuPrep PCR Purrification Kit (hãng Bioneer), cụ thể:
Bước 1: Bổ sung 5 lần thể tích của sản phẩm PCR bằng buffer 1 (PCR Binding Buffer). Hòa tan cho tới khi tan hoàn toàn.
Bước 2: Chuyển hỗn hợp sang tube chứa cột DNA binding và ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút.
Bước 3: Bỏ dịch và bổ sung 500 µl Buffer 2 vào tube chứa cột DNA binding và ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút.
Bước 4: Bỏ dịch và lặp lại bước 3.
Bước 5: Làm khô cột chứa DNA binding bằng cách ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút.
Bước 6: Bổ sung Buffer 3 vào giữa cột và đợi 1 phút tại nhiệt độ phòng. Bước 7: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Bỏ cột, thu dịch. Bảo quản mẫu ở 4oC ta được sản phẩm PCR đã được tinh sạch.
Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch, được điện di kiểm tra lại và được gửi xác định trình tự trên máy xác định trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Data Collection v.1.0 và so sánh với các trình tự trên GenBank.
Cây phát sinh chủng loại đoạn gen mã hóa 16S rRNA của các chủng vi khuẩn và các chủng đại diện được xây dựng dựa trên chương trình Blast, các phần mềm Bioedit, Clustal X và Mega4.