CHƯƠNG I TỔNG QUAN
1.6 THU HỒI ENZYME
1.6.1 Chiết rút enzyme
Trong quá trình sản xuất enzyme bằng lên men chìm hay lên men pha rắn sinh ra hàng trăm loại enzyme khác nhau, đặc biệt là lên men pha rắn lượng tạp chất trong enzyme còn lớn hơn rất nhiều và enzyme gắn bám vào các cơ chất xốp gây khó khăn cho việc nghiên cứu, thu hồi cũng như những các bước sản xuất chế phẩm enzyme tiếp theo. Do đó việc thu hồi enzyme là việc rất quan trọng. Quá trình thu hồi enzyme nhằm chiết rút được những enzyme nhất định, giữ lại được tối đa hoạt tính enzyme và loại bỏ các hợp chất không tan, cô đặc enzyme nhằm phục vụ cho quá trình tinh sạch enzyme hoặc sản xuất các chế phẩm enzyme. Đặc tính tự nhiên của enzyme, nguồn gốc enzyme (từ nấm sợi hay vi khuẩn…) và loại cơ chất sử dụng là 3 yếu tố chính ban đầu đóng vai trị quan trọng trong việc chiết xuất enzyme từ cơ chất rắn (cách lựa chọn dung dịch chiết và phương pháp chiết rút), ngoài ra quá trình chiết xuất thu hồi enzyme trong lên men xốp còn phụ thuộc vào yếu tố như thời gian ngâm chiết, dung dịch chiết, nhiệt độ ngâm chiết và tốc độ khuấy...[115].
Quá trình chiết rút enzyme có thể được thực hiện nhờ các phương pháp lọc hoặc ly tâm đối với lên men chìm và đối với lên men xốp enzyme được chiết xuất cùng các dung môi chiết như nước cất, nước máy, các loại đệm hoặc các loại đệm bổ sung một số chất như chất tẩy rửa nhẹ: SDS, Triton X100, các chất hoạt động bề mặt như Tween 80…[115].
1.6.2 Cô đặc enzyme – tủa enzyme
1.6.2.1 Tủa enzyme bằng muối ammonium sulfate
Ở nồng độ muối cao, phần lớn protein sẽ giảm tính hịa tan, hiện tượng này gọi là tủa bằng muối (salting out). Mỗi loại protein sẽ kết tủa ở một nồng độ muối
nhất định. Vì vậy, hiện tượng tủa bởi muối có thể được dùng để phân đoạn protein. Có thể dùng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ để thu hồi các protein enzyme. Phương pháp này được tiến hành dựa trên cơ sở: độ hòa tan của protein phụ thuộc vào sự tương tác của các nhóm tích điện trong phân tử protein với các phân tử nước. Người ta có thể dùng các muối trung tính để tủa protein vì các muối này vừa làm trung hịa điện tích (do các ion tác động tương hỗ với các nhóm tích điện trái dấu), vừa loại bỏ lớp vỏ hydrat của phân tử protein. Các protein khác nhau có thể bị kết tủa với nồng độ muối khác nhau, vì vậy có thể dùng muối để tách riêng các protein ra khỏi hỗn hợp của chúng. Các muối trung tính có thể dùng là (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4. Tuy nhiên, muối (NH4)2SO4 tốt nhất vì lý do kinh tế và không gây ảnh hưởng đến đa số các loại protein. Hơn nữa, (NH4)2SO4 có độ hịa tan lớn (bão hòa 767 g/l ở 25oC) [165].
1.6.2.2 Tủa bằng dung mơi hữu cơ
Độ hịa tan của protein trong dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một trong số đó là hằng số điện mơi của dung dịch. Nhìn chung, những phân tử dung mơi có hằng số điện môi lớn (nước, dimethylsulphoxyd) có thể ổn định tương tác giữa chúng với các phân tử protein và tạo điều kiện thuận lợi cho sự hòa tan của protein trong dung dịch. Ngược lại, các dung môi với hằng số điện môi nhỏ (aceton, ethanol) ngăn cản sự phân tán của các phân tử protein trong mơi trường. Do đó, độ hịa tan của những phân tử protein giảm và xảy ra kết tủa do sự làm giảm hằng số điện môi hiện hữu của mơi trường. Điều này có được bằng cách thêm một dung mơi hịa tan trong nước như aceton vào dung dịch chứa protein [165].
Khi thêm dung môi hữu cơ vào môi trường, hằng số điện môi tăng lên, khả năng hịa tan của protein giảm, vì thế tạo sự kết tủa. Tuy nhiên, các dung mơi hữu cơ lại có ái lực với các bề mặt kỵ nước của phân tử protein. Kết quả là chúng làm biến tính protein trong suốt q trình tủa. Do đó, khi tủa, chỉ nên sử dụng các dung môi hữu cơ ở nồng độ thấp. Thường các protein bị biến tính bởi các dung mơi hữu cơ nên cần thiết làm việc ở nhiệt độ dưới 0oC [165].
Tủa protein bằng các dung môi hữu cơ như cồn và aceton là sự kết tủa thuận nghịch, khi khơng cịn tác nhân gây kết tủa nữa thì protein lại trở lại trạng thái hồ
tan bình thường. Sự tủa bằng aceton hoặc ethanol có nhiều thuận lợi hơn so với các dung môi hữu cơ khác vì chi phí tương đối rẻ, có sẵn ở dạng tinh khiết với ít chất tạp nhiễm gây độc hay ức chế đối với enzyme, do nhiệt độ bay hơi của dung môi thấp nên dễ tách bỏ dung môi khỏi chế phẩm enzyme bằng phương pháp sấy nhẹ bằng quạt gió. Do bản chất dễ cháy của các dung môi hữu cơ nên cần phải sử dụng thiết bị chịu lửa và giá thành cao, vì thế các dung môi hữu cơ thường không được dùng để tinh sạch enzyme ở quy mô lớn [165].