CHƯƠNG II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1 CHỦNG VI SINH VẬT, MƠI TRƯỜNG, THIẾT BỊ VÀ HĨA CHẤT
NGHIÊN CỨU
2.1.1 Chủng vi sinh vật
Các chủng vi sinh vật được nghiên cứu là các chủng thuộc 3 bộ giống phân lập được từ Sapa (đất rừng Hịang Liên và đất canh tác nơng nghiệp xung quanh rừng thuộc Sapa), tỉnh Lào Cai (274 chủng), từ đất nơng nghiệp Ba Vì (34 chủng) và từ Phú Quốc (38 chủng), hiện đang được lưu giữ tại Bảo tàng giống chuẩn Viện vi sinh vật và Công nghệ sinh học- Đại học quốc gia Hà Nội.
2.1.2 Môi trường nghiên cứu
2.1.2.1 Môi trường sàng lọc chủng ưa nhiệt và môi trường nhân giống
- Môi trường sàng lọc chủng ưa nhiệt: môi trường thạch dinh dưỡng NA (g/l): cao thịt- 3; peptone-5; agar-16; pH 6,8± 0,2; khử trùng 121oC trong 15 phút.
- Môi trường dịch thể: môi trường NA (g/l): cao thịt-3; pepton-10; NaCl- 5; pH 6,8± 0,2, môi trường thạch thường (g/l): cao thịt- 3; pepton- 5, môi trường thạch thường cải tiến (g/l): pepton- 10g; nước mắm đạm trên 40%- 10ml, môi trường Trypticase soy (hãng BBL), môi trường Jorquera (2008) (g/l): Glucose- 10; Na- phytate- 2; CaCl2- 2; NH4NO3- 5; KCl- 0,5; MgSO4.7H2O- 0,5; FeSO4- 0,01; MnSO4- 0,01; khử trùng 2 lần cách nhau 24h, mỗi lần 100oC 15 phút.
2.1.2.2 Môi trường sàng lọc chủng sinh phytase (PSM – phytase screening media)
(g/l): Glucose- 10; Na-phytate- 4; CaCl2- 2; NH4NO3- 5; KCl- 0,5; MgSO4.7H2O- 0,5; FeSO4- 0,01; MnSO4- 0,01; agar- 16, khử trùng 2 lần cách nhau 24h, mỗi lần 100oC/15 phút.
2.1.2.3 Môi trường dịch thể kích thích sinh phytase
Các mơi trường dịch thể sàng lọc vi sinh vật sinh phytase được ký hiệu lần lượt là: K1, K2, G, J, H có cơng thức lần lượt:
-Môi trường K (g/l): cám gạo-50; (NH4)2SO4- 0,4; MgSO4.7H2O- 0,2; CaCl2 – 2,2; pH 6; khử trùng 121oC/15 phút.
- Môi trường K2 (g/l): cám gạo-50; (NH4)2SO4-0,4; MgSO4.7H2O-0,2; CaCl2-2,2; cao men-7,5; methanol-7,5; pH 6, khử trùng 121oC/15 phút.
- Môi trường G (g/l): bột đậu tương- 5; sucrose-1; Asparagin-0,5; KCl-0,5; FeSO4- 0,01; MnSO4- 0,01; pH 5, khử trùng 121oC/15 phút.
- Môi trường J (g/l): Glucose-10; CaCl2- 2; NH4NO3- 5; KCl- 0,5; MgSO4.7H2O- 0,5; FeSO4- 0,01; MnSO4- 0,01; Na-phytate- 0,2%; khử trùng 2 lần cách nhau 24h, mỗi lần 100oC/15 phút.
- Môi trường H (g/l): Glucose- 3; tryptone- 1; CaCl2- 0,3; MgSO4.7H2O- 0,5; MnCl2.4H2O- 0,04; FeSO4.7H2O- 0,0025; Na-phytate- 1; khử trùng 2 lần cách nhau 24h, mỗi lần 100oC/15 phút.
2.1.2.4 Môi trường nuôi xốp
Bảng 2. Các loại môi trường dùng cho lên men xốp
Loại cơ chất Khối lượng tương ứng (g) Thể tích dung dịch làm ẩm (ml) Gạo lức 13 11.5 Gạo lức + bột đỗ tương 10 + 3 11.5 Gạo lức + cám 10 + 3 11.5 Ngô vỡ 13 11.5 Ngô vỡ + bột đỗ tương 10 + 3 11.5 Ngô vỡ + cám 10 + 3 11.5 Cám 13 11.5 Bột đỗ tương 13 11.5
(Dung dịch làm ẩm là môi trường dịch thể Jorquera không bổ sung cơ chất Na- phytate)
2.1.3 Thiết bị
Các thiết bị và máy móc của Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật, Viện Vi sinh vật và công nghệ Sinh học- Đại học Quốc gia Hà Nội gồm bao gồm các thiết bị cho nuôi cấy (a), thiết bị dùng tách chiết và định lượng phytase (b), thiết bị dùng cho các bước phân tích phân loại sinh học phân tử (c):
(a) Máy lắc ổn nhiệt (B. Braun Biotech International -Mỹ), tủ cấy Naure cabinet. (b) Máy rung (Eyela Cute Mixer-1000 -Nhật), máy ly tâm (A15-B.Braun-Đức), máy đo quang phổ- UV 1600 (Thụy Điển).
(c) Bể ổn nhiệt (Ecoline RE 104 -Nhật), máy ly tâm lạnh (C30P-B.Braun-Đức), máy PCR (Mastercycler –Đức), thiết bị điện di (Bio Rad -Mỹ), máy đọc trình tự DNA tự động 3100 Avant (Applied Biosystems, HITACHI -Mỹ).
2.1.4 Hóa chất
Hóa chất dùng cho nghiên cứu được mua tại các hãng tin cậy đảm bảo độ chính xác cho các thí nghiệm. Bao gồm các hóa chất dùng cho ni cấy (i); hóa chất dùng cho tách chiết, định lượng phytase (ii); hóa chất dùng cho phân loại vi khuẩn bằng sinh học phân tử (iii) của các hãng Sigma, Mecrk, Wako, QiaGen, ABI, USB, Plusone, Oxoid.
(i) Glucose, polypepton, pepton, cao malt, cao men, cao thịt, D-galactose, xylose, CMC, Glycerol, manitol, D-lactose, maltose, sucrose, tinh bột tan, urea, (NH4)2SO4, sodium nitrite, sodium nitrate, Potassium chloride, Magnesium sulfate heptahydrate, Manganese(II) sulfate, Calcium chloride, Ethanol, Glycine.
(ii) DMSO (Dimethyl sufoxyde), n-hexane, etylacetate, acetone, ethanol, methanol, isopropanol, Sodium phytate, Tris (hydroxymethyl) aminomethane, Sulfuric axit 98%, Amonium molypdat.
(iii) PCI (phenol/chloroform/isoamylalcohol), protease K, 2-propanol, ethanol, Taq polymerase, dNTPs, mồi, BSA, Bigdye.