CHƯƠNG II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.6.2 Thu hồi enzyme bằng các dung môi hữu cơ
Nuôi các chủng vi khuẩn trên môi trường xốp 3,5 ngày, ủ ở 40oC, thu dịch, chiết tỉ lệ 1:2. Tủa bằng (NH4)2SO4 các phân đoạn từ 30-90%, 50 ml dịch nuôi cấy
enzyme đựng trong ống Falcon 50 đặt trên máy khuấy từ. Muối (NH4)2SO4 được bổ sung vào ở các nồng độ từ 30 đến 90%.
Trong mỗi phân đoạn, (NH4)2SO4 được thêm từ từ vào dịch enzyme và sau đó khi (NH4)2SO4 đã hịa tan hồn tồn, hỗn hợp được ủ ở 0oC trong 30 phút. Ly tâm hỗn hợp tốc độ 10000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC. Chuyển dịch trong sau ly tâm sang một ống Falcon khác, sau đó tiếp tục bổ sung (NH4)2SO4 vào dịch này đến các nồng độ tiếp theo. Cặn sau ly tâm được hòa tan trong nước MQ. Dịch thu được sau khi hịa tan hồn tồn cặn được dùng để xác định hoạt tính phytase.
b/ Tủa enzyme bằng các dung mơi hữu cơ
Nuôi chủng vi sinh vật trên mơi trường xốp thích hợp, sau 3 ngày, chiết dịch enzyme. Tủa enzyme bằng các dung môi hữu cơ (các dung môi hữu cơ được sử dụng là cồn 100% và aceton lạnh):
- Đổ từ từ một lượng dịch enzyme vào bình đựng cồn 100% hoặc acetone lạnh đang được đặt trên máy khuấy từ ở 4o
C theo tỷ lệ thể tích 1:2. Tiếp tục khuấy trong 30 phút để trộn đều hỗn hợp.
- Hỗn hợp trên được đặt vào tủ lạnh ở nhiệt độ - 20oC để qua đêm. - Ly tâm lạnh ở 4oC- 10000 vòng/phút trong 10 phút và thu cặn.
- Bổ sung nước cất vào cặn. Lắc nhẹ bằng máy lắc để từ từ hòa tan cặn. Dịch đã hịa tan được dùng làm dịch enzyme cho các thí nghiệm tiếp theo.