Lên men xốp có nhiều ưu điểm trong q trình sản xuất một lượng lớn các hóa chất và các enzyme. Quá trình này đã được biết đến từ xa xưa và đã có rất nhiều các loại nấm khác nhau được sử dụng trong quá trình lên men xốp để sản xuất thực phẩm, như Aspergillus oryzae được sử dụng trong quá trình lên men của Nhật bản để sản xuất một số loại thực phẩm truyền thống như rượu sake, tương miso, nước
tương shoyu.. , Penicillium roquefortii được sử dụng để sản xuất pho mat. Ở Trung
Quốc lên men xốp cũng được sử dụng rộng rãi trong quá trình sản xuất các thực phẩm được ủ như rượu Trung Quốc, tương và giấm từ thời cổ đại. Ở Nhật bản và nhiều nước khác lên men xốp được sử dụng để sản xuất thương mại các enzyme công nghiệp. Ở Brazil một đất nước có nền nơng nghiệp nhiệt đới rất phát triển, hàng năm thải ra rất nhiều các sản phẩm nông nghiệp thừa và các sản phẩm phụ, năm 1986, một loạt các dự án nghiên cứu tập trung vào sản xuất các phụ gia có giá trị cho các sản phẩm nơng nghiệp nhiệt đới. Ngồi ra, việc sản xuất một lượng lớn các hóa chất và các sản phẩm phụ gia nguyên chất như ethanol, protein đơn bào (SPC), nấm, enzyme, axits hữu cơ, amino axit, các chất trao đổi thứ cấp hoạt tính sinh học...cũng được sản xuất từ những nguyên liệu thô này nhờ kỹ thuật lên men xốp [132].
1.4.2 Những ưu điểm và nhược điểm của lên men xốp
- Lên men xốp cho sản lượng các hợp chất hoạt tính sinh học nhất định cao hơn hoặc bằng so với lên men chìm
- Lên men xốp sử dụng ít nước hơn so với lên men chìm do đó giảm được sự ơ nhiễm nước bởi vi khuẩn hay nấm men. Điều này cho phép lên men xốp trong một số trường hợp được tiến hành trong điều kiện vô trùng.
- Môi trường nuôi cấy xốp khá giống với môi trường sống tự nhiên của vi sinh vật góp phần tạo nên sự phát triển ưu thế của các vi sinh vật được sử dụng trong lên men xốp.
- Giống cấy dạng bào tử (với các quá trình lên men xốp của nấm) có thể được sử dụng giúp cho vi sinh vật dễ dàng phân tán đều vào trong môi trường.
- Mơi trường ni cấy khá đơn giản vì các cơ chất xốp đã cung cấp phần lớn chất dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng của vi sinh vật.
- Nồi phản ứng sinh học có thiết kế khá đơn giản và khơng gian hẹp cũng có thể được sử dụng
- Nhu cầu năng lượng để khử trùng ít, trong một số trường hợp có thể là khử trùng ướt hoặc sục hơi nóng. Khuấy trộn và sục khí khơng cần thiết.
- Thể tích dịng chất thải đầu ra thấp, nhu cầu sử dụng chất để chiết xuất cũng ít hơn do hàm lượng hợp chất hoạt tính sinh học cao hơn nhiều.
- Do mơi trường độ ẩm thấp, có thể giúp vi sinh vật sinh tổng hợp các hoạt chất sinh học đặc thù, mà không sinh tổng hợp hoặc sinh tổng hợp ít ở mơi trường lên men chìm [132].
Bên cạnh những ưu điểm trên, lên men xốp cũng có một số nhược điểm gây khó khăn cho việc nghiên cứu và sản xuất như:
- Việc xác định sinh khối là rất khó khăn do vi sinh vật sinh trưởng trên bề mặt cơ chất xốp.
- Các cơ chất cần được xử lý trước (tiền xử lý) nhằm làm giảm kích thước bằng cách nghiền, xát, xay, đồng nhất hóa, thủy phân bằng enzyme, hóa chất hay vật lý, sục hơi nước….
- Chỉ một số giới hạn các vi sinh vật có thể phát triển được ở điều kiện độ ẩm thấp.
- Môi trường nuôi cấy là các dạng cơ chất rắn, khơng tan do đó khó khăn trong việc kiểm sốt các thơng số quá trình như pH, hàm lượng oxy, độ ẩm…
- Khả năng khuấy trộn khá khó khăn do cơ chất xốp rắn, do đó điều kiện ni cấy tĩnh được sử dụng nhiều hơn.
- Tỷ lệ cấy giống thường lớn
- Việc mở rộng quy mô của các nồi phản ứng sinh học (thiết kế và vận hành) cịn khó khăn do hiện nay cũng chưa có nhiều nghiên cứu cơ bản về lên men xốp. - Khả năng nhiễm các lồi nấm khơng mong muốn khá cao.
- Việc làm giảm nhiệt sản sinh trong suốt quá trình lên men khá khó khăn. - Sản phẩm chứa dịch chiết thu được bằng q trình ngâm, chiết rút có độ nhớt tự nhiên rất cao.
- Trong một số trường hợp, việc sục khí khó khăn do mật độ cơ chất rắn cao. - Khi cấy giống là bào tử vi sinh vật có thường có khoảng thời gian pha lag dài hơn để nảy mầm.
- Đối với lên men chìm thì lên men xốp có thời gian dài hơn [132].
Hiện nay có nhiều loại thiết bị (nồi phản ứng sinh học) chính được sử dụng trong quá trình lên men xốp và trong mỗi loại thiết bị, thiết kế của nó đều nhằm đáp ứng tối ưu hơn cho lên men dưới điều kiện cơ chất rắn: nồi phản ứng sinh học dạng khay, nồi phản ứng sinh học dạng trống nằm ngang, nồi phản ứng sinh học dạng giường chất lỏng (Fluidised- bed)…[132]
1.4.3 Các ứng dụng của lên men xốp
Lên men xốp có 2 lĩnh vực ứng dụng rất quan trọng, đầu tiên đó là ứng dụng trong q trình xử lý sinh học mơi trường như phân hủy sinh học các hợp chất nguy hại, các hợp chất độc từ chất thải của công nghiệp chế biến, sản xuất phân bón, thức ăn động vật từ các chất thải rắn…Một ứng dụng khác của lên men xốp đó là sản xuất các hợp chất làm phụ gia rất có giá trị như enzyme, nấm, aminoaxit, thuốc trừ sâu sinh học, nhiên liệu sinh học, chất hoạt động bề mặt sinh học, hương liệu, chất tạo màu, tạo mùi, chất chuyển hóa thứ sinh có hoạt tính sinh học, và các loại cơ chất khác cần thiết cho công nghiệp thực phẩm.
1.4.3.1 Sản xuất các axit hữu cơ
Các axit hữu cơ được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm do khả năng ngăn chặn được quá trình hư hỏng cũng như kéo dài hạn sử dụng của thực phẩm như axit citric và lactic, axit oxalic, axit gluconic và axit gallic [132].
1.4.3.2 Sản xuất các hợp chất tạo hương và tạo vị.
Các hợp chất tạo hương được sử dụng trong thực phẩm, rượu, gia vị, nước hoa tinh dầu, tuy nhiên trên ¼ trong số chúng được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm. Hầu hết các hợp chất tạo hương này đều được sản xuất theo con đường tổng hợp hóa học hoặc chiết xuất từ các nguyên liệu tự nhiên. Tuy nhiên, từ khi người tiêu dùng ưa chuộng sử dụng các thực phẩm khơng có các hóa chất, thì q trình sinh tổng hợp nhờ vi sinh vật hay biến đổi sinh học là một phương thức tiềm năng trong việc sản xuất các hợp chất tạo hương [132].
1.4.3.3 Sản xuất enzyme
Quá trình sản xuất enzyme ngày càng phát triển mạnh mẽ và enzyme là sản phẩm có nguồn gốc vi sinh vật quan trọng nhất đối với con người. Enzyme có rất nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau như công nghệ sinh học thực phẩm, môi trường, thức ăn động vật, dược phẩm, dệt may, giấy và các ngành cơng nghiệp hóa học và kỹ thuật khác. Do có nhiều ứng dụng rộng rãi trong cơng nghiệp và giá thành khá đắt nên việc nghiên cứu những quá trình sản xuất enzyme nhằm làm giảm tối đa giá thành ngày càng trở nên cần thiết. Lên men xốp ngày được quan tâm do khả năng tạo ra được sản lượng sản phẩm lớn hơn nhiều so với lên men dịch và tận dụng được các nguồn chất thải của các q trình chế biến cơng nghiệp khác do đó giảm giá thành, chi phí sản xuất [132].
1.4.3.4 Sản xuất Fructooligosaccharides
Fructooligosaccharides (FOS), còn được gọi là oligofructose hoặc oligofructan, là oligosaccharides, khi được tiêu hóa sẽ tạo ra rất nhiều lợi ích đối với sức khỏe con người. Thêm vào đó FOS có vai trị quan trọng do chúng là nguồn
cơ chất cho khu hệ vi sinh vật trong ruột già, làm tăng cường sức khỏe của toàn bộ ống dạ dày – ruột [132].
1.4.3.5 Sản xuất các hợp chất hoạt tính sinh học
Các hợp chất hoạt tính sinh học là những thành phần dinh dưỡng bổ sung được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm, bao gồm các chất trao đổi thứ cấp như độc tố nấm, nội độc tố vi khuẩn, alkaloid, các nhân tố sinh trưởng thực vật, chất kháng sinh, màu thực phẩm, các hợp chất phenolic…[132].
1.4.3.6 Sản xuất thuốc trừ sâu sinh học
Các tác nhân kiểm sốt cơn trùng mang tính sinh học ngày càng nhận được nhiều sự chú ý để phát triển thành các loại thuốc trừ sâu thân thiện với môi trường. Một số loại chất thải trong q trình chế biến cơng nghiệp như khoai tây loại, vỏ cà phê và bã mía được sử dụng trong lên men xốp để sản xuất bào tử Beauveria bassiana dùng trong q trình kiểm sốt sinh học cơn trùng của chuối, mía đường,
đậu tương và cà phê. Colletotrichum truncatum là một loại nấm có đặc tính kháng
lại lồi cỏ dại Sesbania exaltata [132].
1.4.3.7 Sản xuất cồn sinh học
Sản xuất cồn sinh học nhờ lên men xốp là lĩnh vực nghiên cứu trước đây không phát triển mạnh mẽ lắm, tuy nhiên trong những năm gần đây cho thấy rằng những giá trị cơng nghệ của nó ngày càng to lớn. Trong q trình lên men xốp để sản xuất cồn sinh học sử dụng bã nho, bã củ cải đường và bã táo là cơ chất rắn được đánh giá cao, đây là môi trường sinh trưởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae cho sản lượng cao hơn rất nhiều khi sản xuất bằng lên men chìm [132].
1.5 CHI BACILLUS VÀ PHÂN LOẠI TRONG CHI BACILLUS
Một trong những vi khuẩn đầu tiên được Ehrenberg mô tả vào năm 1835 là “Vibrio subtilis” [106]. Đến năm 1872, Cohn đã đặt lại tên cho sinh vật này là
Bacillus subtilis. Sinh vật này là một thành viên điển hình của một chi lớn và đa
dạng, được đề xướng bởi Cohn, thuộc về họ Bacillaceae. Bacillus là một chi lớn với gần 200 lồi vi khuẩn hiếu khí, hình que thuộc ngành Firmicutes, có khả năng sinh
nội bào tử với nhiều hình dạng khác nhau như bầu dục, tròn hay cầu hoặc khúc xạ trụ bên trong tế bào, để chống chịu các điều kiện bất thường của môi trường sống. Các bào tử được mô tả lần đầu tiên bởi Cohn trong B. subtilis và sau đó được Koch mơ tả trong vi khuẩn gây bệnh than B. anthracis. Cohn đã phát hiện ra tính kháng nhiệt của bào tử B. subtilis và Koch đã mơ tả chu trình phát triển cuả B. anthracis từ tế bào sinh dưỡng đến bào tử và ngược lại. Vai trị chính của chúng là tham gia vào chu trình nitơ và cacbon, đa số các lồi vi khuẩn Bacillus là không gây bệnh, tuy
nhiên có một số loài được biết đến bởi khả năng gây bệnh cho vật nuôi (như
Bacillus anthracis và Bacillus cereus) và gây bệnh cho côn trùng (như Bacillus thuringiensis). Nhiều loài vi khuẩn Bacillus, đặc biệt là nhóm B. subtilis, có tiềm
năng sản xuất các sản phẩm thương mại ứng dụng trong y học, trong nông nghiệp và trong cơng nghiệp thực phẩm. Vì lẽ đó, Bacillus đã được quan tâm nghiên cứu ở mọi cấp độ trong tế bào như giải mã trình tự genome của vi khuẩn, nghiên cứu cơ chế điều hòa và biểu hiện enzyme và protein, sàng lọc các chất hoạt tính sinh học từ các sản phẩm trao đổi chất bậc hai cũng như ứng dụng các kỹ thuật sinh học hiện đại trong phân loại vi sinh vật ở cấp độ loài và dưới loài [19, 61, 121].
Hệ thống phân loại Bacillus dựa trên phân tích trình tự đoạn gen 16S rRNA bắt đầu từ những năm 1990 [8]. Theo đó, B. subtilis Cohn 1872 và những lồi có quan hệ gần gũi như B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. megaterium, B. coagulans, B. anthracis, B. cereus và B. thuringensis được xếp vào phân nhóm thứ
nhất (hay cịn gọi là nhóm “Bacillus sensu tricto”) trong tổng số 5 phân nhóm. Hơn 20 năm qua, nhiều lồi vi khuẩn có quan hệ gần gũi với B. subtilis đã được phân lập và mô tả. Chúng bao gồm ít nhất 9 lồi là Bacillus amyloliquefaciens , Bacillus atrophaeus, Bacillus axarquiensis, Bacillus malacitensis, Bacillus mojavensis, Bacillus sonorensis, Bacillus tequilensis, Bacillus vallismortis và Bacillus velezensis. Phương pháp phân loại truyền thống dựa trên hình thái tế bào, bào tử
cũng như các đặc tính sinh hóa khơng có khả năng phân tách các lồi này. Hơn nữa, hầu hết các lồi này đều có mức độ tương đồng đoạn gen ADNr 16S rất cao (lớn hơn 99%) mặc dù kết quả lai DNA-DNA của từng loài với B. subtilis nhỏ hơn 70%. Sự giống nhau về đặc điểm sinh hóa và kiểu hình ở mức độ cao này đã gợi ý cho
Gordon và cộng sự (1973) xếp những lồi có quan hệ họ hàng gần với B. subtilis (9 loài vi khuẩn Bacillus trên) vào ‘subtilis-group’ hoặc ‘subtilis-spectrum’ và việc định danh các lồi trong nhóm này địi hỏi phải sử dụng tổ hợp nhiều kỹ thuật phân loại hiện đại. Nhiều lồi trong nhóm này đã được phân tách thành các loài phụ như
B. subtilis được chia thành B. subtilis subsp. subtilis, B. subtilis subsp. spizizenii, B. subtilis subsp. inaquosorum; B. amyloliquefaciens được chia thành B. amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens và B. amyloliquefaciens subsp. plantarum [13, 85, 119]. Bên cạnh việc phân loại dựa trên trình tự gen 16S rRNA,
một số gen khác như DNA gyrase subunit A (gyrA), DNA gyrase subunit B (gyrB) và two-component sensor histidine kinase (CheA) đã được sử dụng phân loại các lồi trong nhóm B. subtilis [21, 114,152]. Gần đây, xây dựng cây phát sinh chủng loại trên trình tự đa gen (gyrA, rpoB, purH, polC, groEL và ADNr 16S) đã được
ứng dụng trong phân loại các loài hoặc dưới loài B. subtilis. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã ứng dụng kỹ thuật phân tích trình tự đa gen để phân loại chính xác đến lồi [62, 119].
Bacillus là một chi vi khuẩn hóa dưỡng vơ cơ phân bố rộng rãi trong tự nhiên,
với đặc điểm điển hình phân biệt với các chi khác trong họ Bacillaceae là sinh trưởng hiếu khí tuyệt đối hoặc tùy tiện, dạng que và sản xuất các enzyme xúc tác ngoại bào và nhiều lồi có sinh ra các chất kháng sinh. Đặc tính chung của Bacillus là vi khuẩn Gram dương, tế bào hình que thẳng, kích thước 0,5-2,5 x 1,2-10µm, hầu hết chuyển động, sinh trưởng hiếu khí hoặc hiếu tùy tiện, hầu hết có phản ứng catalase dương tính, tất cả đều hình thành nội bào tử. Các bào tử không bắt màu Gram, làm biến dạng tế bào hoặc không làm biến dạng tế bào mang của nó tùy theo lồi. Các loài Bacillus đa dạng về sinh lý, sinh thái. Một số chủng có khả năng sinh trưởng tốt trên môi trường chứa glucose, photphatamon và một số muối khoáng khác. Bacillus rất phổ biến trong tự nhiên, nhất là trong đất, ở đây chúng góp phần đáng kể vào sự phân hủy chất hữu cơ nhờ khả năng sinh ra những enzyme có hoạt tính mạnh. Đa số các chủng Bacillus đều sinh trưởng được trong khoảng pH rộng.
chủng ưa axit có khoảng pH là 2,0 - 6,0. Các chủng trung tính sinh trưởng tốt ở pH tối ưu là 7 [106].
Bacillus amyloliquefaciens là một loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus được một nhà khoa học người Nhật bản là Fukumoto phát hiện trong đất năm 1943 và được đặt tên dựa trên khả năng sản xuất amylase ngoại bào (theo tiếng Latin: faciens - sản xuất, lique - lỏng, amylo – amylase). Tại thời điểm đó, B. amyloliquefaciens
được xem như một dịng khác của lồi B. subtilis hay loài phụ B. subtilis subsp.
amyloliquefaciens. Đến năm 1987, B. amyloliquefaciens mới được tách ra thành
một loài riêng dựa trên kết quả lai DNA lần lượt là 23, 15 và 5% so với các loài B.
subtilis, B. licheniformis và B. pumilus [104]. Từ đó đến nay, nhiều chủng B. amyloliquefaciens phân lập từ các hệ sinh thái khác nhau ở các vùng địa lý khác
nhau đã được công bố. Borriss và cộng sự (2010) đã chứng minh sự khác biệt về chỉ số lai ADN, chỉ số so sánh hệ gen, tính tương đồng của tồn bộ hệ genome và phổ