Khi môi trường xốp sau lên men được sấy ở 50oC sau 24-48h và xử lý nhiệt với chính các mẫu lên men xốp đó lần lượt ở các nhiệt độ 60, 70, 80, 90oC trong 30 phút sau đó chiết xuất enzyme và xác định hoạt tính thì thấy khi cơ chất sấy khơ được xử lý ở 90o
C hoạt tính enzyme vẫn cịn 12,5; 19,73 và 31% sau 30, 20, 10 phút xử lý nhiệt. Kết quả cho thấy khi enzyme vẫn ở trong cơ chất được sấy khô, chưa chiết xuất thì tính bền nhiệt của enzyme cao hơn (hình 34). Trong một nghiên cứu của Marshall và cộng sự (1980) cho rằng trong tự nhiên có nhiều enzyme ở dạng glycoprotein và đây là bằng chứng gợi ý rằng carbohydrate khi kết hợp với enzyme sẽ làm cho enzyme bền vững hơn nên các enzyme chứa carbohydrate bền hơn so với các enzyme khơng chứa carbohydrate, vì thế ơng và cộng sự đã quan tâm đến việc cải thiện độ bền của enzyme bằng cách gắn chúng với carbohydrate. Với cách làm này có thể tăng độ bền enzyme khi bảo quản, hoạt tính enzyme vẫn giữ được trong các điều kiện sử dụng bất lợi, chống lại được các tác nhân ức chế enzyme tự nhiên và nhiều các đặc tính quý khác [74].
g/ Ảnh hưởng của enzyme tiêu hóa đến hoạt động của enzyme.
Hình 35. Ảnh hưởng của enzyme tiêu hóa đến hoạt động của phytase chủng SP1901
Một trong những yêu cầu cần thiết đối với enzyme ứng dụng trong chăn ni là phải có khả năng chống chịu được hệ enzyme thuỷ phân trong đường tiêu hoá của động vật. Đặc tính này giúp enzyme thực hiện chức năng xúc tác sinh học trong đường tiêu hố. Chính vì vậy việc nghiên cứu khả năng mẫn cảm với những enzyme
thuỷ phân chủ yếu trong đường tiêu của động vật có ý nghĩa quyết định đến cách ứng dụng của enzyme. Theo kết quả nhận được trong hình 35, phytase của chủng SP1901 khơng bị ảnh hưởng bởi trypsin 0,1 mg/ml pH 8 tuy nhiên lại khá mẫn cảm với pepsin (hoạt tính giảm chỉ cịn gần 30% sau 30 phút tiếp xúc với pepsin). Kết quả này cũng trùng với kết quả nghiên cứu của Powar và cộng sự (1982) khi cho rằng phytase từ Bacillus substilis rất bền dưới tác động của papain, pancreatin, trypsin và elastase tuy nhiên enzyme này lại mẫn cảm với pepsin [101]. Ở các loại phytase khác nhau thì khả năng kháng các enzyme thủy phân protein như pancreatic và pepsin là khác nhau. Phillippy BQ (1999) cho rằng các phytase sẵn có trong lúa mỳ dễ bị bất hoạt bởi pepsin hơn là phytase của A. niger do khi ủ phytase của A. niger và lúa mỳ với 5mg pepsine/ml ở pH 3,5; phytase A. niger vẫn giữ được 95%
hoạt tính cịn phytase trong lúa mỳ chỉ còn giữ 70% hoạt tính ban đầu [100]. Igbasan và cộng sự (2000) cho rằng phytase của E. coli không mẫn cảm với pepsine và pancreatine [49]. Phytase của chủng Shigella sp. CD2 giữ được khoảng 80% hoạt tính sau khi xử lý với pepsine và trypsin 0.1mg/ml trong 60phút và phytase tái tổ hợp từ A. niger trên P. pastoris trong nghiên cứu của Ngô Thanh Xuân và cộng sự
(2011) không mẫn cảm pepsin (2000 U/ml, pH 2) nhưng mẫn cảm với pancreatin (2 mg/ml) [2, 83]. Các sản phẩm phytase thương mại cần có tính kháng các protease trong suốt hệ tiêu hóa của động vật dạ dày đơn tuy nhiên đối với các enzyme khơng có đặc tính này, để khắc phục điều này enzyme phytase có thể được bọc bằng vỏ bọc để vượt qua các khu vực khác nhau trong đường tiêu hóa của động vật. ?
Như vậy với các kết quả nghiên cứu đặc tính enzyme phytase của chủng SP1901 cho thấy rằng: phytase của chủng bền ở 60oC (vẫn giữ được 90% hoạt tính sau 30 phút xử lý ở 60oC), hoạt động tối ưu ở pH 5,6-7,2 và 50oC. Sự có mặt của Ca2+ và Cu2+ làm tăng nhẹ hoạt tính phytase và sự có mặt EDTA từ 2mM trở lên làm ức chế hồn tồn hoạt tính phytase. Ca2+ làm tăng độ bền nhiệt của phytase ở 60 và 70oC, khi khơng có mặt Ca2+ ở 70oC sau 30 phút xử lý hoạt tính chỉ cịn 28% tuy nhiên khi có mặt Ca2+, sau khi xử lý 30 phút ở 70oC hoạt tính vẫn giữ được 95% hoạt tính. Khả năng bền nhiệt của phytase trên cơ chất sấy khô tăng đáng kể, sau 30
phút xử lý ở lần lượt 60, 70 và 80oC hoạt tính phytase giữ được 90, 77 và 49%, sau 10 phút xử lý ở 90oC hoạt tính phytase chỉ cịn 31%. Phytase của chủng SP1901 bền với enzyme tiêu hóa trypsine 0,1mg/ml pH 8 khi được ủ với trypsine trong 30 phút và bị giảm dần hoạt tính khi tăng dần thời gian ủ với pepsine 10 mg/ml pH 3.
KẾT LUẬN
- Từ 346 chủng, đã sàng lọc được 91 chủng chịu nhiệt có khả năng sinh trưởng được ở 40oC. Các chủng này được nuôi trên môi trường PSM, định lượng trên môi trường dịch thể, lên men xốp và kiểm tra khả năng bền nhiệt đã chọn được chủng SP1901 có hoạt tính phytase cao và bền nhiệt.
- Chủng SP1901 được định danh là loài B. amyloliquefaciens subsp. plantarum dựa trên phân tích trình tự ADNr 16S và trình tự kết nối của 6 gen gyrA, rpoB, purH, polC, groEL, 16S rRNA.
- Điều kiện nhân giống thích hợp của chủng SP1901: mơi trường thạch thường ở 40o
C, pH 6, điều kiện hiếu khí sau 16-24 h nuôi cấy.
- Điều kiện lên men xốp thích hợp của chủng SP1901 cho hoạt tính phytase cao nhất: cơ chất là ngô vỡ (đạt 4,68U/g), độ ẩm là 50%, tỷ lệ cấy giống phù hợp nhất là từ 10-20% và sau 84 h nuôi cấy, nguồn cacbon là lactose, glycerol, sucro, CMC và nguồn nitơ là ure. Ion Ca2+ có vai trị rất quan trọng trong q trình sinh tổng hợp phytase ở nồng độ 0,2-0,8%.
- Thu hồi enzyme bằng dung dịch chiết SDS 1% và nước máy cho hiệu quả chiết xuất cao nhất (5,74 và 5,54 U/g). Phytase bị mất hoạt tính hồn tồn ở tất cả các phân đoạn khi tủa bằng (NH4)2SO4, khi tủa bằng cồn và acetone phytase tủa nhiều nhất ở nồng độ 70% đạt 91-95%.
- Phytase của chủng SP1901 bền ở 60oC, hoạt động tối ưu ở pH 5,6-7,2 và 50oC. Sự có mặt của Ca2+ và Cu2+ làm tăng hoạt tính phytase và sự có mặt EDTA từ 2 mM làm ức chế hoàn toàn hoạt tính phytase. Ca2+ làm tăng độ bền nhiệt của phytase ở 60oC và 70oC. Khả năng bền nhiệt của phytase trên cơ chất sấy khô tăng đáng kể, phytase của chủng SP1901 mẫn cảm với pepsine và không mẫn cảm với trypsin.
KIẾN NGHỊ
- Tinh sạch enzyme để sản xuất enzyme dưới dạng các chế phẩm thương mại;
- Tìm kiếm các khả năng sinh các loại enzyme khác nhau của chủng nghiên cứu.
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Đỗ Thị Ngọc Huyền (2007), Nghiên cứu tính chất phytase tự nhiên và tái tổ hợp của vi khuẩn Bacillus subtilis, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Khoa học
và Công nghệ Việt Nam.
2. Ngô Thanh Xuân (2011), Nghiên cứu phytase tái tổ hợp từ Aspergillus niger XP trong Pichia pastoris và bước đầu ứng dụng trong chăn nuôi. Luận án tiến
sĩ, Đại học sư phạm Hà Nôi.
3. Nguyễn Thùy Châu (2009), Hồn thiện cơng nghệ sản xuất enzym phytaza để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi và phục vụ một số ngành công nghiệp. Báo cáo
dự án khoa học kỹ thuật - Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, Viện Cơ
điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch.
TIẾNG ANH
4. Anderson RJ (1914), A contribution to the chemistry of phytin. I. Composition of barium phytate and phytic acid. II. A study of the properties of phytic acid and its decomposition products. Eighth paper on phytin. Journal Biological Chemistry 17: 171-190.
5. Angel R, Tamim NM, Applegate TJ, Dhandu AS, Ellestad LE (2002), Phytic acid chemistry: influence on phytin-phosphous availability and phytase efficacy. Journal Applied Poultry Research 11: 471-480.
6. Alvarez F, Castro M, Principe A, Borioli G, Fischer S, Mori G & Jofre E (2012), The plant-associated Bacillus amyloliquefaciens strains MEP2 18 and
ARP2 3 capable of producing the cyclic lipopeptides iturin or surfactin and fengycin are effective in biocontrol of sclerotinia stem rot disease. Journal of applied microbiology 112(1): 159-174.
7. Arguelles-Arias A, Ongena M, Halimi B, Lara Y, Brans A, Joris B & Fickers P (2009), Bacillus amyloliquefaciens GA1 as a source of potent antibiotics and other secondary metabolites for biocontrol of plant pathogens. Microbial Cell Factories 8: 63.
8. Ash C, Farow JAE, Wallbanks S & Collins MD (1991), Phylogenetic heterogeneity of the genus Bacillus revealed by comparative analysis of small- subunit-ribosomal RNA sequences. Letters in Applied Microbiology 13(4):
202-206.
9. Bae HD, Yanke LJ, Cheng KJ, Selinger LB. (1999), A novel staining method for detecting phytase activity. Journal of Microbiological Methods - Elsevier
10. Baldi BG, Franceschi VR, Loewus FA (1987), Localization of phosphous and cation reserves in Lilium longiflorum pollen. Plant Physiology 83(4): 1018- 1021.
11. Billington DC, editor (1993), The inositol phosphates: chemical synthesis and biological significance. Weinheim Verlag Chemic: 153.
12. Bogar B, Szakacs G, Linden JC, Pandey A, Tengerdy RP. 2003, Optimization of phytase production by solid substrate fermentation. Journal of industrial microbiology and biotechnology 30(3):183-9.
13. Borriss R, Chen XH, Rueckert C, Blom J, Becker A, Baumgarth B, Fan B, Pukall R, Schumann P, Spröer C, Junge H, Vater J, Pühler A, Klenk HP. (2011), Relationship of Bacillus amyloliquefaciens clades associated with
strains DSM 7T and FZB42T: a proposal for Bacillus amyloliquefaciens subsp.
amyloliquefaciens subsp. nov. and Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum subsp. nov. based on complete genome sequence comparisons. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 61(8):
1786-1801.
14. Bourdillon J (1951), A crystalline bean seed protein in combination with phytic acid. Journal Biological Chemistry 189(1): 65-72.
15. Byrd CA, Matrone G (1965), Investigations of chemical basis of zinc-calcium- phytate interaction in biological systems. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine 119: 347-349.
16. Cao H, He S, Wei R, Diong M & Lu L (2011), Bacillus amyloliquefaciens G1: A Potential Antagonistic Bacterium against Eel-Pathogenic Aeromonas hydrophila. Evid Based Complement Alternat Med 2011: 7.
17. Caldwell AG, Black CA (1958), Inositol hexaphosphate. III. Content in soils.
Soil Science Society of America Journal 22: 290-293.
18. Cheryan M (1980), Phytic acid interaction in food systems. CRC critical reviews in food science and nutrition 13: 297-335.
19. Chen XH, Koumoutsi A, Scholz R, Eisenreich A, Schneider K, Heinemeyer I, Morgenstern B, Voss B, Hess WR, Reva O, Junge H, Voigt B, Jungblut PR, Vater J, Süssmuth R, Liesegang H, Strittmatter A, Gottschalk G, Borriss R. (2007), Comparative analysis of the complete genome sequence of the plant growth-promoting bacterium Bacillus amyloliquefaciens FZB42. Nature Biotechnol 25(9): 1007-1014.
20. Choi YM, Suh HJ, Kim JM (2001), Purification and properties of extracellular phytase from Bacillus sp KHU-10. Journal of Protein Chemistry 20(4): 287- 292.
21. Chun J & Bae KS (2000), Phylogenetic analysis of Bacillus subtilis and related taxa based on partial gyrA gene sequences. Antonie Van Leeuwenhoek 78(2):
123-127.
22. Cosgrove DJ, Irving GCJ, editors (1980), Inositol Phosphates: Their chemistry, Biochemistry and Physiology. North Holland, Inc., New York: Elsevie: 191.
23. Davies NT, Nightingale R (1975), The effects of phytate on intestinal absorption and secretion of zinc,and whole body retention of zinc, copper, iron, and manganese in rats. Bristish Journal of Nutriton 34(2): 243-258. 24. Davies NT, A. FA (1978), The similarity between alkaline phosphatase
(EC.3.1.3.1) and phytase (EC.3.1.3.8) activity in rat intestine and their importance in phytate induced zinc deficiency. Bristish Journal of Nutriton
39(2): 307-316.
25. David B, Mitchell, Kurt Vogel, Bernd J, Weimann, Luis Pasamontes, Adolphus P G M, van Loon (1997), The phytase subfamily of histidine acid phosphatases: Isolation of genes for two novel phytases from the fungi
Aspergillus terreus and Myceliophthora thermophila. Microbiology 143: 245-
252.
26. Dvoráková J (1998), Phytase: sources, preparation and exploitation. Folia Microbiologica 43(4): 323-338.
27. Dyer WJ, Wrenshall CL, Smith GR (1940), The isolation of phytin from soil.
Science 91(2361): 319–321.
28. Earl AM, Losick R, Kolter R. 2008, Ecology and genomics of Bacillus subtilis. Trends in Microbiology 16(6): 269-75.
29. Farhat A., Chouayekh H., Mounira B., Bouchaala K., Bejar S. (2008), Gene Cloning and Characterization of a Thermostable Phytasefrom Bacillus subtilis
US417 and Assessment of its Potentialas a Feed Additive in Comparison with a Commercial Enzyme. Molecular Biotechnology 40(2): 127–135.
30. Ferguson EL, Gibson RS, Thompson LU, Ounpuu S (1989), Dietary calcium, phytate, and zinc and the calcium, phytate and zinc molar ratios of the diets of East-African children. The American Journal of Clinical Nutrition 50(6): 1450-1456.
31. Fontaine TD, Pons WA, Irving GW (1946), Protein-phytic acid relationship in peanuts and cottonseed. Journal Biological Chemistry 164(2): 487-507.
32. Fu SJ, Sun JY, Qian LC, Li ZY (2008), Bacillus phytases: Present scenario and future perspectives. Applied Biochemistry and Biotechnology 151(1): 1-8. 33. Graf E, Eaton JW (1993), Suppression of colonic cancer by dietary phytic
34. Greiner R, Konietzny U, Jany KD (1993), Purification and characterization of two phytases from Escherichia coli. Archives Biochemistry and Biophysics
303(1): 107-113.
35. Greiner R, Konietzny U (2006), Phytase for food application. Food Technology and Biotechnology 44: 125-140.
36. Greiner E, Konietzny U (1996), Construction of a bioreactor to produce special breakdown products of phytate. Journal Biotechnology 48(1-2): 153- 159.
37. Gulati H. K., Chadha B. S., Saini H. S. (2007), Production and characterization of thermostable alkaline phytase from Bacillus laevolacticus isolated from rhizosphere soil. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 34(1):
91–98.
38. Gupta R, Beg QK & Lorenz P (2002), Bacterial alkaline proteases: molecular approaches and industrial applications. Applied Microbiology and Biotechnology 59(1): 15-32.
39. Gupta SK, Venkatasubramanian TA (1975), Production of aflatoxyn on soybeans. Applied Microbiology 29(6): 834-836.
40. Ha NC, Oh BC, Shin S, Kim HJ, Oh TK, Kim YO, Choi KY, Oh BH. (2000), Crystal structures of a novel, thermostable phytase in partially and fully calcium-loaded states. Nature Structural & Molecular Biology 7(2): 147-153. 41. Harland BF, Morris ER (1995), Phytin: A good or a bad food component.
Nutrition Research 15: 733-754.
42. Harland BF, Oberleas D (1987), Phytate in Foods. World Review of Nutrition & Dietetics 52: 235-259.
43. Hartig T (1855), Über das Klebermehl. Bot Ztg 13: 881-882.
44. Hartig T (1856), Weitere mittheilungen das klebermehl (Aleuron) betreffend.
Bot Ztg 14: 257-268.
45. Hawkins PT, Poyner DR, Jackson TR, Letcher AJ, Lander DA, Irvine RF (1993), Inhibition of ironcatalysed hydroxyl radical formation by inositol polyphosphates: a possible physiological function for myo-inositol hexakisphosphate. Biochemical Journal 294(3): 929-934.
46. Honke J, Kozlowska H, Vidal-Valverde C, Frias J, Gorecki R (1998), Changes in quantities of inositol phosphates during maturation and germination of legume seeds. Z Lebensm Unters Forsch A 206: 279-283.
47. Idriss EE, Makarewicz O, Farouk A, Rosner K, Greiner R, Bochow H, Richter T, Borriss R. (2002), Extracellular phytase activity of Bacillus amyloliquefaciens FZB45 contributes to its plant-growth-promoting effect. Microbiology 148(7): 2097-2109.
48. Igbal TH, Lewis KO, T. CB (1994), Phytase activity in the human and rat small intestine. Gut 35(9): 1233-1236.
49. Igbasan FA, Männer K, Miksch G, Borriss R, Farouk A SO (2000), Comparative studies on the in vitro properties of phytases from various microbial origins. Archives of Animal Nutrition 53(4): 353-373.
50. IUB (1979), Enzyme nomenclature. In: Recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry. New
York: Academic Press: 247.
51. Jackson JF, Jones G, Linskens HF (1982), Phytic acid in pollen.
Phytochemistry 21(6): 1255-1258.
52. Jacobsen T, Slotfeldt DE (1983), Phytic acid and metal availability: a study of Ca and Cu binding. Cereal Chemistry 60: 392-395.
53. Katayama T (1995), Effect of dietary sodium phytate on the hepatic and serum levels of lipids and on the hepatic activities of NADPH-generating enzymes in rats fed on sucrose. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 59(6): 1159- 1160.
54. Kerovuo J, Lauraeus M, Nurminen P, Kalkkinen N, Apajalahti J (1998), Isolation, characterization, molecular gene cloning and sequencing of novel phytase from Bacillus subtillis. Applied Environmental Microbiology 64(6): 2079-2085.
55. Kerovuo J (2000), A Novel Phytase from Bacillus. Characterization and Production of the Enzyme, PhD thesis, Faculty of Science, University of
Helsinki, Finland.
56. Kerovuo J, Lappalainen I, Reinikainen T (2000), The metal dependence of
Bacillus subtilis phytase. Biochemical and Biophysical Research Communications 268(2): 365-369.
57. Kim YO, Kim HK, Bae KS, Yu JH, Oh TK (1998), Purification and properties of a thermostable phytase from Bacillus sp. DS11. Enzyme and Microbial
Technology 22(1): 2-7.
58. Knuckles BE (1985), Effect of phytate and partially hydrolyzed phytate on in vitro protein Digestibility. Journal of Food Science 50(4) : 1080–1082.
59. Konietzny U, Greiner R, editors (2003), Phytic acid and nutritional impact. 2 ed. Amsterdam: Elsevier Science: 4546-4563.
60. Kostrewa D, Wyss M, D'Arcy A, van Loon APGM (1999), Crystal structure of