Chương 3 : Nội dung, vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.3 Vật liệu nghiên cứu
3.3.1 Mẫu vật dùng trong nghiên cứu
Mẫu dùng để khảo sát đánh giá tỷ lệ bảo hộ, đáp ứng miễn dịch sau tiêm phòng bệnh dại và khả năng tồn trữ mầm bệnh dại ngoài tự nhiên là mẫu máu (huyết thanh) của chó, mèo và một số động vật hoang dã (chuột cống, sóc nhen, dơi).
Hình 3.1: Động vật hoang dã (chuột, sóc nhen, dơi) được lấy mẫu
Mẫu dùng để khảo sát mối tương quan di truyền giữa các chủng virus dại thực địa với chủng vaccine đang sử dụng (93127FRA (GU992320.1, Pháp) và sadWistar_3_var01 (LN713659, Đức)) và các chủng virus dại trong khu vực ((U0520629 (KM366216.1), V0808656 (KM366221.1) và V0627625 (KM366222.1)) là mẫu não (sừng Amon, tiểu não, bán cầu não) của động vật nghi mắc bệnh dại.
Mẫu não của động vật nghi mắc bệnh dại được lấy như sau: từ thông tin của tất cả Thú y của các tỉnh ĐBSCL về triệu chứng lâm sàng trên động vật nghi mắc bệnh dại, sau đó xin ý kiến lấy mẫu của cơ quan Thú y có thẩm quyền tại địa phương. Tiếp theo con vật được xử lý và lấy đầu sau đó bỏ vào 3 lớp ni lon rồi đem trữ trong thùng đá và vận chuyển ngay đến Chi cục Thú y vùng VI ở TP.HCM để chẩn đoán xét nghiệm.
3.3.2 Hóa chất và sinh phẩm chính sử dụng trong nghiên cứu
Các hóa chất và sinh phẩm được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: Kháng thể kháng Nucleocapside virus dại gắn huỳnh quang (Bio-Rad cung cấp) (Bảo quản ở 2- 8oC), dung dịch Glycerol buffer (Bảo quản ở 2-8oC), dung dịch đệm phosphate pH 7,4 (PBSx10), glycerine, Evans Blue 1% (Bio-Rad cung cấp) (Bảo quản ở 2-8oC), nước cất, acetone, cồn, crezyl, NaCl, KH2PO4, Tampon (PBS 10X của Bio-rad cung cấp), tiêu bản dương tính, âm tính, bộ kit SERELISA®Rabies Ab Mono Indirect (Pháp), bộ kit chiết xuất QIAamp* Viral RNA Mini Kit (Cat.No 52904), QIAquick ® PCR Purification kit, (hãng Qiagen), Cat. 28104, Kit QIAquick Gel Extraction kit, (hãng Qiagen), cat:28704……
3.3.3 Trang thiết bị, dụng cụ chính sử dụng trong nghiên cứu
Thiết bị: Autoclave, tủ ấm, tủ sấy, tủ lạnh -20oC, tủ ấm 37oC, máy ly tâm, máy Real time PCR, máy ELISA, máy vortex, đèn cực tím, buồng cấy vơ trùng (Biosafety cabinet Class II), máy đo bước sóng hiệu BIO-TEX (Mỹ) model Epoch, Hệ thống điện di Gelmate 2000 (Toyobo), máy chụp hình gel Chemdoc XRS, máy luân nhiệt Minicycler (MJ Research), máy giải trình tự 3130 genetic analyzer…
Hình 3.3: Máy giải trình tự gen
Hình 3.4: Hệ thống Real time PCR (Viện Pasteur TP. HCM, 2020)
Hình 3.6: Máy ly tâm Hermle
Dụng cụ: Ống nghiệm nút vặn, đĩa Petri, bình tam giác, đèn cồn, lam kháng
acetone, Lammel, giấy thấm, kẹp giải phẫu, pen, kéo, tube Eppendorf (Rnase/Dnase free), Micropipette đơn: 0,5 - 10 µl, 2 - 20 µl, 20 - 200 µl, 200 - 1000 µl, đầu tube có lọc: 10 µl, 20 µl, 200 µl, 1000 µl, Micropipette đa kênh…
3.3.4 Biểu mẫu thu thập thông tin
Nghiên cứu tiến hành thu thập thông tin thông qua các biểu mẫu được thể hiện qua phụ lục, bao gồm:
- Phiếu điều tra tổng đàn chó, tỷ lệ tiêm phịng, tỷ lệ chó mắc bệnh dại các năm từ 2017 đến 2020 và tình hình tiêm phịng dại trên người do chó, mèo cắn (cào);
- Phiếu lấy mẫu máu xét nghiệm kháng thể kháng virus dại; - Phiếu khảo sát cộng đồng về bệnh dại.