Chương 3 : Nội dung, vật liệu và phương pháp nghiên cứu
4.6. Khảo sát mối tương quan di truyền giữa các chủng virus dại thực địa với chủng
4.6.1 Kết quả thực hiện phản ứng rt-pcr và đăng ký trên genbank (ncbi)
Sản phẩm PCR thu được có kích thước khoảng 600bp, kết quả điện di thể hiện chất lượng tốt (hình 4.9). Sau khi giải trình tự, sử dụng phần mềm Bioedit để đọc kết quả và cắt bỏ những nucleotide ở phần đầu và cuối của trình tự xi và ngược. Sau khi xử lý trình tự một phần gen N của bốn mẫu RABV ở Hà Tiên (1230.2019), Cà Mau (20328.2018; 1231.2019) và Trà Vinh (1229.2019) có kích thước 533 bp. Trình tự nucleotide 4 chủng này được công bố trên NCBI với các mã số tương ứng như sau: MK790256, MK790254, MK790257, và MK790255. Những trình tự này được sử dụng để so sánh với các chủng virus dại vaccine.
Ghi chú
Giếng 1: Thang chuẩn 100 bp plus
Giếng 2: mẫu não chó bệnh Hà Tiên-Việt Nam thu năm 2019 Giếng 3: Đối chứng dương
Giếng 4: Đối chứng âm
4.6.2 Phân tích cây phát sinh lồi
Hình 4.15: Cây phát sinh lồi các chủng virus dại
Hình 4.15 thể hiện cây phát sinh lồi (phylogenetic tree) với hệ số Bootstrap là 1.000 được chia thành 2 nhánh lớn: nhánh A và nhánh B. Trong đó nhánh A gồm 5 chủng virus dại và chủ yếu là các chủng vaccine sadWistar_3_var01 (LN713659, Đức), sad Batch793_3_var01 (LN713576, Đức), RB/E3-15 (EU182346_1, Trung Quốc), RABV (M13215_1, Mỹ), và 93127FRA (GU992320.1, Pháp). Các chủng phát hiện được ở Hà Tiên, Cà Mau và Trà Vinh như 1230.19-Ha Tien (MK790256.1), 20328-Ca Mau.18 (MK790254.1), 1231.19 Ca Mau (MK790257.1) và 1229.2019 Tra Vinh (MK790255.1) được nhóm chung nhóm với nhau và cùng nhóm với các chủng tham chiếu phát hiện tại Campuchia như U0520629 (KM366216.1), V0808656 (KM366221.1) và V0627625 (KM366222.1); cùng thuộc nhóm B. Do đó, các chủng phát hiện được trong nghiên cứu này có thể có quan hệ di truyền gần với các chủng virus dại ở Campuchia. Theo nghiên cứu trước đó của Mey et al., (2016), các chủng U0520629 (KM366216.1), V0808656 (KM366221.1) và V0627625 (KM366222.1) phân lập được tại Campuchia thuộc dịng SEA1 ở Đơng Nam Á; những chủng này có quan hệ gần với các chủng virus dại phát hiện được ở Thái Lan, Lào. Dòng SEA1 được xác định trước
đó bởi Yamagata et al. (2007); các chủng virus thuộc dòng này chủ yếu lưu hành tại Thái Lan, Việt Nam, Campuchia và Lào. Xét về mặt địa lý cho thấy Campuchia và Lào nằm giữa Việt Nam và Thái Lan nên khả năng virus dại ở các nước này có mối quan hệ di truyền cao là phù hợp. Bên cạnh đó, điều kiện tự nhiên ở những nước này gần như khơng có sự khác biệt; việc bn bán khơng hợp pháp chó hoang giữa các quốc gia này có thể là nguyên nhân góp phần cho sự lây lan virus dại dịng SEA1 ở các quốc gia này. Hơn nữa, những nghiên cứu trước đây cho thấy nhánh B chủ yếu chứa virus dại đang lưu hành ở Việt Nam, Trung Quốc, Philippines (May et al., 2016; Ahmed et al. 2015). Do đó, có thể kết luận các chủng phát hiện được trong nghiên cứu có thể có nguồn gốc từ thực địa và có quan hệ di truyền gần với các chủng virus dại đang lưu hành tại các nước Đông Nam Á như Campuchia, Lào và Thái Lan.
4.6.3 Khoảng cách di truyền và phân tích trình tự
Kết quả phân tích tỷ lệ tương đồng về nucleotide các chủng phát hiện được với các chủng tham chiếu bằng phương pháp so sánh cặp (Compute Pairwise Distance) sử dụng phần mềm MEGA7.0 cho thấy các chủng 1230.19-Ha Tien (MK790256.1), 20328-Ca Mau.18 (MK790254.1), 1231.19 Ca Mau (MK790257.1) và 1229.2019 Tra Vinh (MK790255.1) có độ tương đồng cao với nhau với tỷ lệ tương đồng từ 98,30% đến 99,06%; và tương đồng cao nhất với các chủng ở Campuchia như U0520629 (KM366216.1), V0627625 (KM366222.1), và V0808656 (KM366221.1) với tỷ lệ tương đồng 98,30% đến 99,81%. Bên cạnh đó các chủng phát hiện ở nghiên cứu này có độ tương đồng thấp so với các chủng vaccine với tỷ lệ tương đồng và nucleotide từ 84,67% đến 86,35%. Kết quả này phù hợp với kết quả phân tích phả hệ di truyền trước đó ở Hình 4.18
Cho đến thời điểm ngày nay, có nhiều nghiên cứu về sự lưu hành và phân tích di truyền phả hệ virus dại ở trên thế giới. Nghiên cứu trước đó của Chiou et al. (2016) cho thấy 97 - 99% tương đồng về nucleotide gen N của virus dại ở ba chủng phân lập từ Taiwan Ferret Badgers. Jamil et al. (2012) đã công bố 98 - 100% tương đồng nucleotide gen N của virus dại từ bảy mẫu não. Reddy et al. (2011) tìm thấy 88,8 - 99,7% sự tương đồng của gen N giữa 30 chủng virus dại tại Ấn Độ và chủng virus Pasteur tiêu chuẩn. Nagrajan et al. (2009) nhận thấy rằng các chủng virus dại Nam Ấn Độ tương đồng hơn 95%. Bên cạnh đó, Susetya et al. (2008) so sánh 34 chủng virus dại đã phân lập với 20 chủng virus dại từ các vùng khác và ba chủng virus vaccine cho thấy sự tương đồng nucleotide là 88,4 - 90,2, 86,1 - 88,4, 85,9 - 87,4 và 86,2 - 87,4% với trình tự chủng virus dại từ Trung Quốc, Thái Lan, Ấn Độ và Shri Lanka, tương ứng. Kết quả nghiên của nghiên cứu này cịn phù hợp với cơng bố trước đó của Chiou et al. (2016), Jamil et al. (2012) và Nagrajan et al. (2009).
Tóm lại, qua phân tích di truyền và hệ và so sánh tương đồng nucleotide giữa các chủng virus dại phát hiện được ở Hà Tiên, Cà Mau và Trà Vinh với các chủng tham chiếu cho thấy các chủng phát hiện được ở nghiên cứu có nguồn gốc từ thực địa, có quan
hệ di truyền gần với các chủng đang lưu hành tại các nước Đông Nam Á như Campuchia, Lào và Thái Lan.
Bảng 4.31: So sánh mức độ tương đồng về nucleotide giữa các chủng phát hiện được với các chủng tham chiếu Mã số_Chủng (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) Tỷ lệ tương đồng nucleotide (%) 1 KM366216.1_U0520629 2 LN713659.1_SadWistar_3 _var01 85,65 3 LN713576.1_SadBatch793 _3_var01 85,41 99,44 4 EU182346.1_RB/E3-15 85,65 100,00 99,44 5 M13215.1_PV 85,43 98,87 98,68 98,87 6 GU992320.1_93127FRA 85,41 99,63 99,06 99,63 98,87 7 KM366222.1_V0627625 99,81 85,41 85,17 85,41 85,19 85,17 8 KM366221.1_V0808656 99,81 85,41 85,17 85,41 85,19 85,17 99,63 9 MK790256.1_1230.2019 (HaTien) 99,81 85,42 85,17 85,42 85,19 85,17 99,63 99,63 10 MK790254.1_20328.2018 (CaMau) 98,30 85,15 84,91 85,15 84,69 84,67 98,11 98,11 98,11 11 MK790257.1_1231.2019 (CaMau) 98,49 86,35 86,11 86,35 85,89 85,87 98,30 98,30 98,30 99,06 12 MK790255.1_1229.2019 (TraVinh) 99,25 85,39 85,15 85,39 85,41 85,39 99,06 99,06 99,06 98,11 98,30
MK790256.1_1230.2019 (HaTien), MK790254.1_20328.2018 (CaMau), MK790257.1_1231.2019 (CaMau), MK790255.1_1229.2019 (TraVinh) với các chủng tham chiếu KM366216.1_U0520629, LN713659.1_SadWistar_3_var01, LN713576.1_SadBatch793_3_var01, EU182346.1_RB/E3-15, M13215.1_PV, GU992320.1_93127FRA, KM366222.1_V0627625, KM366221.1_V0808656
Hình 4.16: So sánh trình tự nucleotide của các chủng phát hiện được
Trình tự nucleotide một phần gen N virus dại các chủng 1230.19-Ha Tien (MK790256.1), 20328-Ca Mau.18 (MK790254.1), 1231.19 Ca Mau (MK790257.1) và 1229.2019 Tra Vinh (MK790255.1) đã được căn chỉnh và so sánh với các chủng tham chiếu tại Campochia và chủng vaccine như U0520629 (KM366216.1), V0627625 (KM366222.1), V0808656 (KM366221.1), sadWistar_3_var01 (LN713659, Đức), sad Batch793_3_var01 (LN713578, Đức), RB/E3-15 (EU182346_1, Trung Quốc), RABV (M13215_1, Mỹ), và 93127FRA (GU992320.1, Pháp). Chủng U0520629 (KM366216.1) được phân lập ở Campuchia được sử dụng như chủng tham chiếu để xác định các vị trí khác biệt về nucleotide giữa các chủng. Kết quả cho thấy trình tự nucleotide của các chủng phát hiện được ở nghiên cứu có ít sai khác (16/571 vị trí, Hình 4.20). Trong khi đó, các chủng vaccine có nhiều vị trí sai khác hơn so với chủng tham chiếu. Những vị trí sai khác này chủ yếu do đột biết thay thế. Kết quả này phù hợp với kết quả phân tích di truyền phả hệ và so sánh tương đồng trước đó.
4.6.4 Đề xuất các biện pháp phịng chống
Bệnh dại có nhiều trung gian truyền bệnh như chó, mèo, dơi, chuột, … và vật chủ cuối cùng chính là con người. Do đó để xây dựng quy trình phịng bệnh dại trên động vật và người cần phải giảm thiểu các nguồn truyền lây virus dại, giảm thiểu số người bị tử vong do bệnh Dại. Một số giải pháp quan trọng bao gồm:
4.6.4.1 Quản lý đàn chó, mèo
Chính quyền địa phương (cấp xã) tổ chức quản lý việc ni chó, mèo trên địa bàn: lập danh sách hộ ni hoặc sổ quản lý chó, mèo, hàng năm cập nhật số liệu chó, mèo cần tiêm phòng trước đợt tiêm phòng tập trung để cung cấp cho cơ quan thú y;
Chủ ni chó, mèo có nhiệm vụ thơng báo với chính quyền địa phương về số lượng, giống, tình trạng tiêm phịng vaccine,…. Chủ ni chó, mèo phải có biện pháp quản lý chó, mèo (nhốt, xích) và giữ chúng trong khn viên gia đình, hạn chế thả rong trong
nhà, ngoài đường. Ở nơi công cộng, nơi đông dân cư, khu đô thị khi đưa chó ra ngồi, phải nhốt, giữ chó trong chuồng, cũi hoặc phải rọ mõm và có người dắt.
Đối với chó, mèo hoang phải tiến hành quây bắt để tiêm phịng vaccine dại, có thể thống kê số lượng để thuận tiện cho việc quản lý, đồng thời thành lập các tổ chức nhân đạo chăm sóc chó, mèo hoang. Vận động người dân khai báo khi phát hiện chó, mèo hoang cho chính quyền địa phương để xử lý kịp thời.
Chính quyền các cấp phải nhanh chống xử lý các ổ dịch bệnh xảy ra. Tiến hành tiêu hủy chó, mèo mắc bệnh dại. Nếu chó, mèo nghi mắc bệnh dại khi cắn, cào người thì phải nhốt theo dõi trong 90 ngày dù có hay khơng có tiêm vaccine. Chó, mèo nghi nhiễm bệnh dại phải nhốt, theo dõi trong 15 ngày.
4.6.4.2 Tiêm phịng vaccine dại cho chó mèo
Tất cả chó, mèo trong diện tiêm phịng bắt buộc phải được tiêm vaccine phòng bệnh dại, bảo đảm mỗi con được tiêm ít nhất 1 lần trong năm và nâng cao tỷ lệ tiêm phòng. Tổ chức tháng cao điểm tiêm phịng vaccine dại cho chó, mèo (tháng 3 – 4 hằng năm) thực hiện tiêm bổ sung chó bị bỏ sót hoặc mới phát sinh. Vaccine tiêm phịng bệnh dại cho chó, mèo phải có trong danh mục vaccine, chế phẩm sinh học, vi sinh vật, hoá chất dùng trong thú y được phép lưu hành tại Việt Nam và phải được bảo quản, sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất hoặc của cơ quan thú y.
Chủ ni chó, mèo phải chấp hành tiêm phịng vaccine dại cho chó, mèo nuôi. Nếu không chấp hành sẽ bị xử phạt vi phạm theo quy định pháp luật. Chó, mèo sau tiêm phịng vaccine dại sẽ được cơ quan thú y cấp giấy hoặc mã vạch chứng nhận tiêm phòng theo quy định. Sau tiêm phịng, chủ vật ni có trách nhiệm theo dõi và giám sát các biểu hiện bất thường của chó, mèo. Nếu phát hiện con vật có biểu hiện bất thường hoặc vơ cớ cắn, cào người, động vật khác thì phải nhốt ngay con vật đó, con vật đã bị cắn, cào để theo dõi và báo ngay cho chính quyền địa phương.
Khuyến cáo chủ vật nuôi tiến hành tẩy giun sán cho chó, mèo định kỳ và trước khi tiêm vaccine bệnh dại từ 7 – 10 ngày, để nâng cao hiệu quả đáp ứng miễn dịch sau tiêm phòng. Chủ vật ni nên chủ động tiêm phịng dại cho chó, mèo trước khi phối giống để tăng hàm lượng kháng thể mẹ truyền và nâng cao tỷ lệ bảo hộ cho đàn con, vì chó mẹ có thời gian sau tiêm phịng từ 10 - 12 tháng thường khơng cịn đủ kháng thể để truyền cho chó con, và những chó con trên 6 tuần tuổi thì lượng kháng thể thụ động nhận từ mẹ cũng sẽ giảm dưới ngưỡng bảo hộ.
Sau tiêm phịng Chính quyền địa phương có thể lấy mẫu để kiểm tra hiệu quả đáp ứng miễn dịch sau tiêm phòng vaccine bệnh dại 21 ngày. Nếu tỷ lệ bảo hộ sau tiêm phịng đạt kết quả thấp thì phải tổ chức tiêm phòng lại. Nghiên cứu, sản xuất các test kit chẩn đoán nhanh nhằm phát hiện kháng thể virus dại đang lưu hành tại Việt Nam hỗ trợ công tác đánh giá hiệu quả sau tiêm phòng vaccine dại, phát hiện các dạng dại tiềm ẩn trên chó, mèo và một số động vật khác.
4.6.4.3 Điều trị dự phòng cho người sau phơi nhiễm
Người bị chó, mèo cào cắn phải được đưa đến cơ quan y tế dự phòng để kiểm tra và tiêm phòng kịp thời, đồng thời nhốt chó, mèo lại để theo dõi 15 ngày. Trường hợp khơng biết rõ nguồn gốc của con chó, mèo đã cắn người thì phải áp dụng ngay các biện pháp điều trị dự phịng cho người như bị chó, mèo dại cắn. Để chủ động phịng, chống bệnh dại trên đàn chó, mèo bảo vệ sức khỏe, đảm bảo an tồn tính mạng con người; các hộ chăn ni chó, mèo cần thực hiện tốt “5 khơng”: Khơng ni chó, mèo khi chưa khai báo với chính quyền địa phương; Khơng ni chó, mèo khơng được tiêm vắc xin phịng bệnh dại; Khơng ni chó thả rơng; Khơng để chó cắn người; Khơng ni chó, mèo gây ơ nhiễm môi trường.
Xây dựng kế hoạch quốc gia về cung ứng, sử dụng vaccine phòng dại cho người bị chó cắn, người có nguy cơ cao phơi nhiễm bệnh dại. Kiện toàn và mở rộng số lượng các điểm tiêm vaccine và huyết thanh kháng dại phục vụ công tác điều trị dự phòng, đảm bảo khả năng dễ tiếp cận, giá thành thấp, đặc biệt ở khu vực có nguy cơ cao. Tại cơ sở tiêm phịng đảm bảo đủ trang thiết bị, vaccine và huyết thanh kháng dại đã được cấp phép sử dụng có chất lượng cao, an tồn, ít phản ứng phụ cho các điểm tiêm phịng.
Khuyến khích các địa phương hỗ trợ tiêm vaccine miễn phí cho người nghèo ở khu vực có nguy cơ cao như vùng đồng bào dân tộc thiểu số, vùng sâu, vùng xa, vùng đặc biệt khó khăn. Khuyến cáo tiêm vaccine dự phòng trước phơi nhiễm cho người có nguy cơ cao như người ở trong vùng dịch, vùng có nguy cơ mắc bệnh dại cao, các cán bộ thú y địa phương, người hành nghề thú y chuyên điều trị bệnh cho chó, mèo,….
4.6.4.4 Hoàn thiện các văn bảng quy phạm pháp luật, tuyên truyền nâng cao nhận thức của người dân về mức độ nguy hiểm của bệnh Dại
Hoàn thiện các văn bản quy phạm pháp luật theo hướng răn đe và nâng cao nhận thức của người ni chó, mèo về mức độ nguy hiểm của bệnh dại. Có thể xem xét tăng mức xử phạt vi phạm trong phòng, chống bệnh dại ở động vật. Kinh phí thực hiện tiêm phịng do chủ vật ni thanh tốn hoặc do chính quyền địa phương xem xét hỗ trợ tiêm phòng vaccine dại.
Tuyên truyền phổ biến các văn bản pháp luật, các chính sách của Nhà nước về phịng, chống bệnh dại; các quy định liên quan và trách nhiệm của người ni chó, mèo. Tuyên truyền về việc hạn chế ni chó, mèo, nếu gia đình có nhu cầu ni thì chỉ nên ni 01 con để giảm tổng đàn chó, mèo của Việt Nam. Nếu chủ vật ni khơng đủ điều kiện kinh tế ni dưỡng, có thể hạn chế số lần đẻ trong suốt đời sống của chó, mèo để giảm số lượng chó mèo hoang.
- Tuyên truyền nâng cao nhận thức cộng đồng về sự nguy hiểm của bệnh dại và các biện pháp phòng chống bệnh dại ở người; hướng dẫn người bị chó cắn xử lý y tế ban đầu ngay sau khi bị chó cắn và đến các cơ sở y tế để được điều trị dự phòng kịp thời. Tăng cường vận động cộng đồng cùng tham gia giám sát, phòng chống bệnh dại trên
người và động vật. Phát động và tổ chức ngày "Thế giới phòng chống bệnh dại" vào ngày 28/9 hàng năm tại Việt Nam. Tuyên truyền việc xây dựng vùng an toàn bệnh dại.
4.6.4.5 Nâng cao năng lực chuyên mơn, giám sát, chẩn đốn và xét nghiệm trong phòng chống bệnh dại
Chuẩn hóa chương trình tập huấn và tài liệu đào tạo về phòng chống bệnh dại cho hệ thống y tế, thú y về vaccine phòng bệnh dại cho người và động vật; kỹ năng thu thập, bảo quản và vận chuyển mẫu bệnh phẩm động vật nghi mắc bệnh dại, bảo đảm an toàn cho người thực hiện và chất lượng của mẫu; quản lý đàn chó địa phương, kỹ năng bắt chó, mèo thả rơng; kỹ năng truyền thơng cộng đồng trong cơng tác phịng, chống bệnh dại.
Tập huấn kỹ năng điều tra, giám sát, chẩn đoán xác định bệnh dại (ở chó và ở người), phân tích tình hình dịch tễ, xác định vùng, nhóm người có nguy cơ lây truyền bệnh dại, tiêm phịng vaccine dại cho chó, mèo và cho người có nguy cơ cao, xử trí vết cắn và điều trị dự phịng dại cho người bị chó, mèo cắn, xử lý ổ dịch bệnh dại.