Chương 2 : Tổng quan tài liệu
2.1 Virus gây bệnh dại
2.1.8 Sự truyền lây và cơ chế gây bệnh của virus dại
Sự lây truyền xảy ra thường là do sự xâm nhập của nước bọt chứa virus dại vào mô bào sau khi bị động vật mang virus dại cắn. Mặc dù trong một số trường hợp có thể là do virus từ nước bọt, tuyến nước bọt hoặc từ não con vật mắc bệnh lây nhiễm qua vết thương trên da hoặc có thể qua niêm mạc. Thơng thường, nước bọt có tính truyền lây tại thời điểm xuất hiện các triệu chứng lâm sàng; nhưng chó nhà, mèo và chồn có thể bài xuất virus vài ngày trước khi xuất hiện triệu chứng. Thời kỳ ủ bệnh kéo dài và biến động. Đặc trưng của virus nằm ở vị trí xâm nhập trong một thời gian tương đối dài. Độ dài ngày trong thời kỳ ủ bệnh có thể do hoạt động hữu hiệu của globulin miễn dịch với virus dại tại chỗ sau phơi nhiễm ở người. Trong đa số các trường hợp, virus dại trên chó sẽ phát bệnh trong vòng 21- 80 ngày sau phơi nhiễm, nhưng thời gian ủ bệnh có thể ngắn hoặc dài hơn. Một trường hợp bệnh dại ở người được báo cáo ở Mỹ có thời gian ủ bệnh trên 6 năm (Begeman et al., 2018; Udow et al., 2013).
Virus lây truyền hướng thần kinh ngoại biên vào tủy sống và đi lên não (Hình 2.3). Sau khi vào não, virus di chuyển theo thần kinh ngoại biên xuống tuyến nước bọt. Nếu động vật có khả năng truyền lây virus dại qua nước bọt, virus có thể phát hiện thấy trong não. Virus được bài xuất trong nước bọt khơng liên tục (Udow et al., 2013; Hemachudha
Hình 2.3: Quá trình sinh bệnh dại ở người (Shite et al., 2015)
Virus dại không truyền lây qua đường máu. Sự truyền lây qua khơng khí xảy ra khi khơng khí chứa nồng độ cao các hạt lơ lửng mang virus và nó khơng gây nguy hiểm. Sự truyền lây qua khơng khí xảy ra khi truyền lây bệnh thực nghiệm hoặc trong tự nhiên ở những hang động có hàng triệu con dơi cư ngụ. Các chất tiết ở miệng và mũi chứa virus có thể được hóa bụi từ 10.000 con dơi mang virus dại. Nhiễm trùng qua khơng khí có thể xảy ra qua con đường gắn virus vào các đầu mút thần kinh khứu giác (Udow et al., 2013; Piccinotti and Whelan, 2016;).
Quá trình lây nhiễm virus dại được chia thành ba giai đoạn. Giai đoạn đầu: virus gắn vào các thụ thể trên tế bào chủ nhạy cảm, bắt đầu sự xâm nhập trực tiếp bằng phản ứng dung hợp của virus với màng sinh chất của tế bào chủ và giải phóng RNP dạng xoắn. Giai đoạn thứ hai: quá trình phiên mã bộ gen và tổng hợp protein của virus. Giai đoạn thứ ba: lắp ráp thành cấu trúc hoàn chỉnh và đi ra khỏi tế bào bị nhiễm virus. (Albertini et al., 2011; Piccinotti and Whelan, 2016).
2.1.8.1 Giai đoạn đầu: vai trò của thụ thể RABV, nội bào và hợp nhất qua trung gian G
Sự lây nhiễm RABV bắt đầu khi virus bám vào bề mặt của tế bào đích và xâm nhập vào tế bào thơng qua con đường vận chuyển nội bào (Hình 2.4). Rất có thể, virus tự gắn vào đơn vị thụ thể (cellular receptor unit = CRU) trên bề mặt tế bào để xâm nhập
trực tiếp vào các tế bào nhạy cảm hoặc tế bào đích. Một trong những CRU này là thụ thể nicotinic acetylcholine (nAChR) được tìm thấy tại các điểm nối thần kinh cơ. Tuy nhiên, không phải tất cả các tế bào bị nhiễm RABV in vitro bao gồm tế bào thần kinh đều có biểu hiện nAChR. Khả năng khác là phân tử kết dính tế bào thần kinh CD56 trên bề mặt các tế bào nhạy cảm với RABV và thụ thể tế bào thần kinh p75 ái lực thấp (p75NTR). Ngồi ra, cịn phụ thuộc vào sự phát triển hệ thống thần kinh. Một số nghiên cứu gần đây cho thấy mGluR2 cũng là đơn vị thụ thể tế bào. Điều này cho thấy virus không bị giới hạn bởi một loại thụ thể đặc hiệu nào để bắt đầu quá trình lây nhiễm bệnh cho động vật (Piccinotti and Whelan, 2016; Wang et al., 2018).
Sau khi virus liên kết với thụ thể trên tế bào chủ, RABV sẽ tiến hành nhập bào bằng cách xâm nhập vào các viropexis (sự cố định virus) hoặc ẩm bào. Một phần của quá trình nhập bào là sự hợp nhất giữa màng virus và màng nội bào được kích hoạt trong mơi trường acid (pH 6,3 - 6,5) kích thích phản ứng tổng hợp, một loạt các thay đổi cấu trúc cụ thể diễn ra trong RABV G, theo đó nó giả định ít nhất ba trạng thái “cấu trúc” riêng biệt về cấu trúc (Albertini et al., 2012; Piccinotti and Whelan, 2016).
Trước khi liên kết với thụ thể tế bào, trên bề mặt virion G ở trạng thái nguyên bản. Sau khi virus gắn vào thụ thể và được nhập bào, G được “kích hoạt” sang trạng thái kỵ nước, cho phép nó tương tác với màng nội chất kỵ nước. Khi đi vào nội bào có mơi trường pH thấp sẽ kích hoạt khả năng dung hợp của G thông qua sự thay đổi cấu trúc trong G làm bộc lộ vùng dung hợp và tương tác với màng tế bào đích (Sakai et al., 2004; Albertini et al., 2012). Sau đó một cấu trúc giả định G dung hợp bị bất hoạt làm cho G xuất hiện lâu hơn cấu trúc “bản địa” và giả định sự phân biệt kháng nguyên có chọn lọc. G dung hợp bất hoạt rất nhạy cảm với các protease tế bào và dường như ở trạng thái cân bằng động với G “bản địa” được điều chỉnh bằng cách hạ thấp và tăng độ pH. Các MAbs nhận biết các biểu mô cấu trúc nhạy cảm với pH thấp, có thể xác định các thay đổi cấu trúc do acid gây ra, cũng như phát hiện các giai đoạn khác nhau của quá trình tạo ra G mới và sự liên kết của nó với các chaperones phân tử (Kankanamge et al., 2003).
Hình 2.4: Quá trình lây nhiễm của virus dại (Fooks and Jackson, 2020)
2.1.8.2 Giai đoạn thứ hai: Phiên mã, sao chép và tổng hợp protein
Giải phóng RNP của virus bắt đầu bằng việc phiên mã, sao chép và tổng hợp protein của bộ gen RNA. Quá trình phiên mã hệ gen vRNA được bắt đầu trong tế bào chất của tế bào bị nhiễm. Với sự phân ly của M khỏi RNP, thì cấu trúc RNP sẽ giãn ra và tạo thành một chuỗi xoắn lỏng lẻo, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình sao chép vRNA. RNP có vai trị là khn mẫu để tổng hợp RNA, có khoảng 50 RNA polymerase liên kết với RNP (L-P). Một số nghiên cứu cho thấy polymerase bắt đầu phiên mã ở đầu 3’ của RNA hoặc ở mRNA virus. Sự tái nhập polymerase được giải phóng sau phiên mã gen L hoặc polymerase dẫn đến phiên mã gradient điển hình, trong đó mARN của gen gần 3' được phiên mã nhiều hơn (Lahaye et al., 2009; Nikolic et al., 2017).
Các protein virus được tổng hợp từ các mRNA của virus thông qua sự tổng hợp protein của tế bào chủ. G-mRNA được dịch mã trên các polyribosome liên kết màng (polysomes) và được đưa vào ER, tại đây hình thành liên kết disulfua sau đó nó được vận chuyển ra khỏi ER. Bốn mRNA khác của virus (N-, P-, M- và L-mRNA) được dịch mã trên các polysome “tự do” trong tế bào chất. Khi M tích tụ trong tế bào chất của tế bào bị nhiễm có khả năng tương tác đặc biệt với yếu tố khởi đầu quá trình dịch mã của các sinh vật nhân chuẩn, đồng thời kiểm sốt q trình dịch mã trong các tế bào bị nhiễm để dịch mã mRNA của virus. Sự tích lũy của các protein virus khác, đặc biệt là N và P bắt đầu sao chép, bao gồm tổng hợp N-encapsidation của N-cRNA. Chúng đóng vai trị
như các khn mẫu để khuếch đại N-vRNA của bộ gen, có thể phục vụ trong q trình phiên mã (thứ cấp) và biểu hiện protein (Lahaye et al., 2009; Nikolic et al., 2017).
Sự tích tụ của các protein dẫn đến sự hình thành các IB trong tế bào chất, chúng tăng kích thước theo thời gian. Các IB này được gọi là NB trong tế bào thần kinh, có thể dễ dàng phát hiện bằng cách nhuộm và được dùng trong chẩn đoán nhiễm RABV. Các IB là nơi sản xuất virus với các đặc tính của bào quan lỏng. Các IB chứa tồn bộ bộ máy sao chép (bao gồm protein N, P và L, vRNA, cRNA và mRNA, cũng như protein M và một số tế bào protein bao gồm HSP70 và FAK, tương tác với protein N và P). Nucleocapsid của virus được đẩy ra khỏi IB và tạo thành virion mới hoặc nhà máy sản xuất virus thứ cấp. Các mRNA của virus luôn nhiều hơn so với các RNP của bộ gen, nghĩa là quá trình phiên mã của mRNA vẫn là phương thức tổng hợp RNA chính trong suốt q trình lây nhiễm. Ban đầu các protein được tạo ra để sao chép vRNA, ở các giai đoạn sau, chúng cần với số lượng lớn để lắp ráp virus thế hệ sau. Khn mẫu N-vRNA cần cho cả hai q trình này và được sản xuất ở mức cao hơn so với cRNA (Nikolic et al., 2017; Fouquet et al., 2015).
2.1.8.3 Giai đoạn thứ ba: Sự lắp ráp và xâm nhập của virus thế hệ sau
Quá trình lắp ráp virus (hình thái RABV) bắt đầu ở giai đoạn giữa của vịng đời. Bắt đầu q trình này là sự hình thành vRNA-N-P, virus cần đủ lượng N, P và L để hỗ trợ sự hình thành RNP. Sự phát sinh hình thái của RABV có liên quan đến sự hình thành các IB (NB) như các vị trí tập hợp virus ở các tế bào thần kinh trong mô não, cũng như trong nuôi cấy mô. Sự kết hợp của RNP thế hệ sau và các virion vẫn tiếp tục và các tế bào vẫn hoạt động về mặt trao đổi chất (Nikolic et al., 2017; Mavrakis et al., 2003).
M là protein virus tiếp theo liên kết với phức hợp RNP. M xâm nhập vào việc lắp ráp virus như một protein hòa tan trong tế bào chất, nó tham gia vào tất cả các bước dẫn đến sự xâm nhập của virus. M là một protein đa chức năng và nó đóng vai trị quan trọng trong hình thành virus thế hệ sau. Đầu tiên, sự liên kết của M với RNP trong hoạt động phiên mã làm thay đổi sự cân bằng giữa phiên mã và sao chép RNA của virus bằng cách ức chế phiên mã và kích thích sao chép. Cuối cùng, M làm thay đổi cấu trúc của RNP bằng cách biến nó thành một dạng "giống như bộ khung". Trong chức năng này của M, virus bắt đầu xâm nhập màng tế bào nơi chúng được bao bọc bởi màng tế bào và xâm nhập vào quá trình xâm nhập của virus. Trong virion dại trưởng thành, M nằm giữa lớp vỏ kép lipid (được hình thành do tương tác với màng tế bào chủ) và RNP dạng xoắn. Do đó, M và RNP đóng một vai trị quan trọng trong q trình hình thành virion và tạo hình thái hình viên đạn (Finke et al., 2003). Nếu RABV có chứa gai G trên bề mặt thiếu M dẫn đến sự biến đổi hình thái làm cho RNP khơng ngưng tụ. RABV thiếu M làm tăng kết hợp tế bào và tăng cường chết tế bào. Sự lắp ráp và xâm nhập của các hạt hình viên đạn có thể xảy ra khi khơng có gai G và sự xâm nhập của virus kém hiệu quả hơn nhiều khi khơng có M (Nakahara et al., 2003).
Trong giai đoạn cuối của q trình lắp ráp RABV, các virion trưởng thành có lớp vỏ lipid kép làm cho RNP+M xuyên qua màng sinh chất của tế bào chủ. Tuy nhiên, các virion cũng có thể trưởng thành nội bào thơng qua ER hoặc tế bào Golgi, thường thấy ở các tế bào thần kinh bị nhiễm bệnh (Finke et al., 2010). Sự tương tác của G với M là cần thiết cho sự ổn định của G trên bề mặt virion và sự xâm nhập hiệu quả của RABV. Không loại trừ khả năng các cấu trúc khung có thể hình thành từ các vùng màng nơi khơng có G. Trong trường hợp này, sự xâm nhập sẽ khơng hiệu quả và các hạt hình viên đạn được tạo ra sẽ khơng có gai (khơng có G) và khơng có khả năng lây nhiễm. Nếu xâm nhập qua màng ER hoặc Golgi, chúng sẽ xâm nhập vào lòng của các túi được tạo ra từ các màng này và có thể được tiết ra từ tế bào qua con đường bài tiết bình thường (Callaway and Luo, 2015).
2.1.8.4 Sự lây nhiễm từ tế bào này sang tế bào khác của virus thế hệ sau
Hầu hết các nghiên cứu về sinh học, hóa sinh và di truyền ngược của tế bào RABV được thực hiện trong hệ thống nuôi cấy tế bào không phân cực, kết quả của những nghiên cứu này không phản ánh hành vi tự nhiên của các chủng RABV hoặc “đường phố” được phân lập từ động vật. Những thay đổi cần thiết để tạo ra các chủng RABV cố định hoặc chủng RABV khác và có thể ảnh hưởng đến việc sử dụng thụ thể, sao chép, vận chuyển nội bào và xâm nhập tế bào (Schnell et al., 2010). RABV hoang dã có xu hướng xâm nhập nhanh chóng vào hệ thống miễn dịch thần kinh và đã phát triển nhiều đặc điểm góp phần vào hành vi “xâm lấn”. Chúng bao gồm kích thích thần kinh, cơ chế vận chuyển trục, các công cụ để làm giảm các phản ứng miễn dịch bẩm sinh, thích ứng và ngăn ngừa tổn thương tế bào thần kinh sớm, cũng như các cách để can thiệp vào sự di chuyển của các tế bào miễn dịch thông qua nghẽn mạch máu não (Ghanem and Conzelmann, 2016).
Protein G xác định sự khác biệt về kiểu hình của các virus liên quan đến tính xâm lấn thần kinh và độc lực. Protein G giúp virus lây nhiễm sang nhiều tế bào in vitro và in vivo, bao gồm cả tế bào cơ, tế bào hình sao, tế bào oligodendrocyte và tế bào thần kinh. Nhiễm trùng tế bào hình sao, tế bào đệm thần kinh trong thần kinh trung ương phụ thuộc vào chủng được sử dụng. Khi ở trong tế bào thần kinh, RABV dường như chỉ được truyền tới các tế bào thần kinh trước synap nhưng các cơ chế cho sự chọn lọc này vẫn chưa được hiểu rõ. Các yếu tố giải phóng virus tại các vị trí màng sau synap góp phần cho sự xâm nhập khơng giới hạn của RABV ở các màng chuyên biệt (Pfefferkorn et al.,
2016; Tian et al., 2017).
Quá trình truyền ngược của RABV giữa các tế bào thần kinh bằng cách liên kết virus với tế bào thần kinh. Tuy nhiên, trong cách tiếp cận này việc phân biệt các tế bào thần kinh bậc 1, bậc 2 và bậc cao hơn rất khó khăn do sự truyền ngẫu nhiên thay vì truyền đồng thời qua các khớp thần kinh. Một vai trị quan trọng có thể là do sự tương tác của virus với thụ thể của RABV là p75NTR. Quá trình vận chuyển tích cực theo trục
của p75NTR đã được chứng minh là giúp xâm nhập nhanh hơn vào thần kinh trung ương (Gluska et al., 2014; Ghanem and Conzelmann, 2016).
Sau khi hợp nhất màng ở pH thấp và giải phóng các RNP, virus nhân lên trong các NB, phần lớn ở thân tế bào thần kinh. Tuy nhiên, bước cuối cùng của quá trình vận chuyển virus trong tế bào thần kinh bao gồm vận chuyển virus mới hoặc các thành phần virus riêng lẻ đến đuôi gai theo hướng phản phân lớp và giải phóng tại các khu vực sau synap. Nghiên cứu sâu hơn về giai đoạn cuối này là cần thiết để có cái nhìn sâu sắc về cơ chế lây lan và tìm ra cách can thiệp điều trị (Pfefferkorn et al., 2016; Gluska et al.,
2014).
Sự truyền lây trực tiếp từ tế bào này sang tế bào khác mặc dù có sự hiện diện liên tục của RNA trong huyết thanh và ít nhất vẫn có thể tồn tại ở nhánh dịch thể của các cơ chế bảo vệ miễn dịch trong q trình lây nhiễm. Điều trị dự phịng sau phơi nhiễm bệnh dại với RNA đã được chứng minh là đáng tin cậy nếu được áp dụng ngay sau khi phơi nhiễm, bằng cách vơ hiệu hóa hầu hết các loại virus tự do trước khi chúng xâm nhập vào tế bào thần kinh. Cho dù các tế bào thần kinh bị nhiễm RABV có thể bị phá hủy bởi các tế bào của hệ thống miễn dịch (Callaway and Luo, 2015; Ghanem and Conzelmann, 2016).