CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.2.5 Phương pháp xác định hoạt tính FPase (FPU)
Dựa trên sự thủy phân giấy lọc bằng dịch cellulase sau đó bất hoạt enzyme và tạo phản ứng màu bằng DNS. Lượng glucose tạo ra được xác định bằng phương pháp đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm (Ghose, 1987).
Ống thử: Cho vào 1 ống nghiệm (25 mL) thủy tinh gồm các chất sau: Giấy lọc Whatman đã cắt nhỏ (khoảng 50 mg), thêm vào đó 1 mL đệm Na-citrate 0,05M, pH 4,8. Sau đó hút 0,5 mL dịch enzyme cần xác định cho vào ống nghiệm rồi nâng nhiệt ống nghiệm lên 500C trong thời gian 60 phút. Tiếp theo cho thêm vào ống nghiệm 3 mL dung dịch DNS, lắc đều rồi tiến hành đun sôi ống nghiệm trong bể cách thủy chính xác trong 5 phút. Làm lạnh ống nghiệm bằng nước đá. Cuối cùng thêm 20 mL nước cất và tiến hành đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm.
Ống blank: Làm tương tự như ống thử nhưng thay vào đó là cho enzyme đã bị bất hoạt trước đó.
Như vậy độ hấp thụ A của mẫu thử = độ hấp thụ của ống thử - độ hấp thụ ống blank
38
Pha dung dịch glucose gốc thành dung dịch có nồng độ: 10 mg/mL (gọi là dung dịch glucose gốc)
Tiếp tục pha loãng thành các nồng độ như sau:
Hút 1 mL glucose gốc + 0,5 mL đệm = 1:1,5 = 6,7 mg/mL (3,33 mg/0,5 mL) Hút 1 mL glucose gốc + 1 mL đệm = 1:2 = 5 mg/mL (2,5 mg/0,5 mL)
Hút 1 mL glucose gốc + 2 mL đệm = 1:3 = 3,3 mg/mL (1,67 mg/0,5 mL) Hút 1 mL glucose gốc + 4 mL đệm = 1:5 = 2 mg/mL (1 mg/0,5 mL) Đường chuẩn glucose được lập như sau:
Ống Zero 1 2 3 4
Glucose đã pha loãng (mL) 0 0,5 0,5 0,5 0,5
Đệm (mL) 1,5 1 1 1 1 500C trong 60 phút DNS (mL) 3 3 3 3 3 Đun sôi 5 phút, làm lạnh Nước cất 20 20 20 20 20 Nồng độ glucose trong ống (mg) 0 3,33 2,5 1,67 1 Công thức tính: FPU = 0,37
Nồng độ enzyme pha loãng tương tứng với thủy phân tạo ra được 2 mg glucose (U/mL)