CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.2.10 Xác định protein tổng số theo phương pháp Bradford
Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Bradford (Bradford, 1976). Phương pháp này dựa trên nguyên tắc: các protein khi phản ứng với Coomassie Brilliant Blue sẽ hình thành phức hợp màu có khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh nhất ở bước sóng 595 nm, cường độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong dung dịch. Hàm lượng protein tổng số được xác định dựa vào đồ thị chuẩn protein từ dung dịch albumin huyết thanh bò.
2.2.2.11 Xác định hàm lượng đường tổng bằng phương pháp PSA (DuBois et al., 1956; Krishnaveni et al., 1984) al., 1956; Krishnaveni et al., 1984)
❖ Hóa chất
- Phenol 5%
41
- Acid hydrochloride (HCl) 2,5N
- Sodium carbonate anhydrous (Na2CO3)
- Dung dịch glucose chuẩn 1000ppm: Hòa tan 0,1 g glucose trong 100 mL nước cất.
- Dung dịch glucose mẫu 100ppm: hút 10 mL dung dịch glucose chuẩn 1000ppm, thêm nước cất định mức thành 100 mL
❖ Cách tiến hành
Cân 100 mg mẫu vào ống nghiệm. Tiến hành đun cách thủy với 5 mL dung dịch HCl 2,5N trong vòng 3 giờ, sau đó để ở nhiệt độ phòng.
Trung hòa nó với Na2CO3 cho đến khi hết sủi bọt khí. Định mức thành 100 mL. Lập đường chuẩn với các dung dịch glucoza chuẩn 100ppm và tiến hành tạo phức màu theo mẫu trong bảng:
Đường chuẩn xác định đường tổng được xây dựng như sau:
Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 M Chuẩn glucoza 100ppm 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Dịch xác định (mL) 0,2 Nước cất (mL) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0,8 Phenol (mL) 1 1 1 1 1 1 1 H2SO4 đậm đặc (mL) 5 5 5 5 5 5 5
Hàm lượng glucose chuẩn (mg) 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1
Lắc đều trong 10 phút, sau đó ngâm trong nước khoảng 25-30oC trong 20 phút rồi đo quang ở bước sóng 490 nm
Xây dựng đồ thị đường chuẩn trong đó, trục hoành là nồng độ chất chuẩn, trục tung là độ hấp thu. Lập phương trình đường chuẩn y=ax.
❖ Tính kết quả
Hàm lượng đường tổng (%) = C x 𝑉đ𝑚
𝑉𝑥đ x 100
𝐺 x K Trong đó:
K: Hệ số pha loãng mẫu
100: Hệ số chuyển đổi sang đơn vị phần trăm
C: lượng glucose được suy ra từ đồ thị đường chuẩn (mg) Vđm: thể tích định mức dịch mẫu (mL)
Vxđ: thể tích dịch mẫu hút đem đi phản ứng với thuốc thử (mL)