G= (100−𝑊) 𝑚
2.3.13 Thí nghiệm 14-15: Khảo sát ảnh hưởng của (NH4)2SO4 và NaCl đến khả năng kết tủa enzyme cellulase
năng kết tủa enzyme cellulase
Mục đích: Tìm ra loại muối và nồng độ muối thích hợp nhằm đạt hiệu quả kết tủa
tốt nhất mà không làm biến tính enzyme.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm tiến hành với 1 nhân tố.
Nhân tố L: Nồng độ muối amoni sulfate (NH4)2SO4
L1: 35 ÷ 45% L3: 55 ÷ 65% L5: 75 ÷ 85% L7: Đối chứng L2: 45 ÷ 55% L4: 65 ÷ 75% L6:85 ÷ 95%
Nhân tố M: Nồng độ muối NaCl (%, w/v)
M1: 15 M3: 25 M5: 35
M2: 20 M4: 30 Số nghiệm thức: 12
Số mẫu thí nghiệm: 12 x 3 lần lặp lại = 36 mẫu. Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Dung dịch muối (NH4)2SO4 và NaCl Làm lạnh 40C ± 0,50C Dịch enzyme thô (40C ± 0,50C) Kết tủa NaCl (%, w/v) (NH4)2SO4 (%, v/w) M4 M3 M2 M1 M5 L6 L5 L4 L3 L2 L1 L7 Lắc nhẹ, ổn định 2 giờ ở 40C Ly tâm 10000 vòng trong 20 phút, 40C
Thu lấy kết tủa
58
Hình 2.17 Sơ đồ kết tủa enzyme cellulase bằng muối vô cơ
Cách tiến hành: Dung dịch enzyme thô được làm lạnh đến 40C trước khi thực hiện quá trình kết tủa.
Dịch enzyme thô được tiến hành kết tủa phân đoạn bằng muối ammonium sulfate bão hòa bắt đầu từ 45% đến 95% hoặc sodium chloride bão hòa từ 15% đến 35%. Đầu tiên, cho một thể tích xác định của dịch enzyme thô đã làm lạnh vào trong ống ly tâm. Từ bảng tra nồng độ bão hòa muối (NH4)2SO4, NaCl, tính toán được khối lượng muối cần thiết phải cho vào dung dịch để đạt được nồng độ bão hòa tương ứng. Cho muối từ từ vào dung dịch enzyme và lắc đều cho đến khi muối tan hoàn toàn. Quá trình kết tủa được thực hiện trong vòng 2 giờ ở 4°C, tiếp theo kết tủa được tách ra bằng máy ly tâm 10000 vòng/phút trong 20 phút ở 4ºC. Sau quá trình ly tâm, kết tủa được tách ra và phần dung dịch còn lại được đem đi xác định thể tích và tiến hành tính toán xác định lượng muối cần thiết cho vào để đạt được nồng độ bão hòa kế tiếp. Các bước tiếp theo cũng được thực hiện như lúc đầu và cho đến nồng độ bão hòa cuối cùng. Sau đó, kết tủa thu được ở các phân đoạn muối bão hòa khác nhau sẽ được hòa tan trở lại bằng dung dịch đệm citrate (pH 4,8) với thể tích vừa đủ. Tiếp theo, phần kết tủa được hòa tan sẽ đem đi thẩm tích trong dung dịch đệm citrate (pH 4,8) bằng màng cellophane trong vòng 12 giờ. Sau cùng, ứng với từng phân đoạn muối bão hòa xác định hoạt tính, hàm lượng protein của cellulase và tính toán hiệu quả tinh sạch enzyme.
Chỉ tiêu theo dõi: Hoạt tính enzyme cellulase, hàm lượng protein
Kết quả thu nhận: Chọn được loại muối kết tủa và nồng độ thích hợp mà tại đó
hoạt tính cellulase là cao nhất hoặc độ tinh sạch cao nhất.