Sự chuyển hoá các hợp chất lân hữu cơ thành muối của H3PO4 (Stoklaza– 1991; Menkina – 1952) theo sơ đồ hình 1.1
Sơ đồ của quá trình phân giải nucleoprotein:
Nucleoprotein Nucleinaxit nucleicNucleotic H3PO4
Lơxitin Glixerphosphat H3PO4
Hình 1.1. Sơ đồ chuyển hoá các hợp chất lân hữu cơ thành muối của H3PO4Vi sinh vật phân giải lân hữu cơ chủ yếu gồm các chủng Bacillus và Vi sinh vật phân giải lân hữu cơ chủ yếu gồm các chủng Bacillus và Pseudomonas.
- Bacillus mycoides: Vi khuẩn hình que, dài khoảng 1,6 – 3,6µ, rộng khoảng 0,5 - 1µ, phân bố rộng rãi trong tự nhiên và là vi khuẩn yếm khí, có tiêm mao ở đầu và quanh cơ thể. Trên môi trường thạch, khuẩn lạc gần giống khuẩn lạc của nấm. Nó có thể phân giải lân hữu cơ và amôn hoá protit nhưng không sinh H2S.
- Bacillus megaterium var phosphaticum: Vi khuẩn hình que, có nha bào, yếm khí tuỳ tiện, có khả năng phân giải lân hữu cơ rất mạnh.
Bacillus là trực khuẩn gram dương, sinh bào tử, chiều ngang của bào tử không vượt quá chiều ngang của tế bào vi khuẩn, do đó khi có bào tử vi khuẩn không thay đổi hình dạng, bào tử của vi khuẩn này có sức sống rất lâu.
Ngoài ra, còn có các vi khuẩn như: Bacillus cereus, Bacillus asterosporus,Pseudomonas sp cũng có khả năng phân giải lân hữu cơ. Ngày nay, ngoài vi khuẩn, người ta còn thấy xạ khuẩn, nấm cũng có khả năng phân giải lân hữu cơ (Dương Hồng Dật, 1979).
Vi sinh vật phân giải lân vô cơ
Quá trình có thể phân giải lân vô cơ theo phương trình sau:
Ca3(PO4)2 + 2 H2CO3 + H2O Ca(H2PO4)2. H2O + 2 Ca(HCO3)2
Trong đất, vi khuẩn nitrat hoá và vi khuẩn chuyển hoá lưu huỳnh cũng có tác dụng quan trọng trong việc phân giải Ca3(PO4)2. Vì trong quá trình sống, các vi khuẩn này tích luỹ trong đất HNO3 và H2SO4. Quá trình hoà tan có thể biểu thị theo các phương trình sau:
Ca3(PO4)2 + 4 HNO3 Ca(H2PO4)2 + 2 Ca(NO3)2
Ca3(PO4)2 + 2 H2SO4 Ca(H2PO4)2 + 2 CaSO4
Các điều kiện ảnh hưởng tới khả năng phân giải lân của vi sinh vật gồm có: - Độ pH: nhìn chung pH, ít ảnh hưởng đến khả năng phân giải lân. Tuy nhiên pH trong khoảng 7,8 – 7,9 ảnh hưởng tốt tới sự phát triển của hệ vi sinh vật phân giải lân
- Nhiệt độ: các chủng vi sinh vật có nhiệt độ thích hợp cho quá trình phân giải lân là khác nhau. Nhìn chung, khoảng nhiệt độ thích hợp nằm trong khoảng 20 – 40oC.
- Hợp chất hữu cơ: chất hữu cơ làm tăng quá trình sinh trưởng của vi sinh vật. Do đó khả năng phân giải lân của chúng sẽ tăng lên.
- Độ ẩm: ở những nơi có độ ẩm cao, do hoạt động của vi sinh vật mạnh nên tạo ra nhiều axit hữu cơ làm tăng phân giải lân.
- Hệ rễ: hệ rễ cây trồng khích thích sự sinh trưởng của vi sinh vật. Do đó phân giải lân cũng được tăng cường. Tuy nhiên một số loài cây có thể tiết ra các chất độc ngăn cản sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật.Tỷ lệ N và C trong môi trường: N, C là những thành phần cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Tỉ lệ N, C trong môi trường cao sẽ thúc đẩy khả năng phân giải lân (Dương Hồng Dật, 1979).
2.2.3. Khả năng cố định Nitơ của vi sinh vật
Trong suốt quá trình cố định đạm sinh học N2 giảm trong hệ thống vận chuyển điện tử kết quả tạo NH3 và phóng thích H2. NH3 sau đó được sử dụng để tổng hợp các chất khác. Quá trình chuyển N2 thành NH3 được xúc tác bởi phức hệ enzyme nitrogenase với sự tham gia của năng lượng ATP. Enzyme dinitrogenase reductase và dinitrogenase có các tiểu đơn vị nif (γ2 homodimeric azoferredoxin) và NifD/K (α2β2 heterotetrameric molybdoferredoxin). Điện tử chuyển từ ferredoxin (hoặc flavodoxin) đến dinitrogenase reductase và chuyển đến dinitrogenase, cung cấp điện tử dưới dạng H2 đến các N2 tạo thành NH3. Mỗi mol N2 được cố định cần có 16 ATP và có sự tham gia của protein nifH (Kneip
et al., 2007).
Phức hợp enzyme nitrogenase và enzyme hydrogenase tổng hợp N2 thành NH3 theo sơ đồ sau:
Ammonia được tạo ra trong chu trình tiếp tục kết hợp với chuỗi carbon để đồng hóa thành những acid amin đầu tiên cung cấp trực tiếp cho cây trồng. Nitrogenase là một phức hệ enzyme, enzyme này được điều khiển bởi hệ thống gen nif có trong bộ genome của tế bào vi khuẩn. Enzyme nitrogenase không chỉ xúc tác cho quá trình tổng hợp N2 thành NH3, mà còn có thể xúc tác khử các chất CH3CN, HCN, NH3, N2O, C2H2, ... thành các sản phẩm tương ứng như C3H6, CH4, H2, N2, C2H4 (Kneip et al., 2007).
2.2.4. Khả năng tổng hợp IAA của vi sinh vật
Indole-3-acetic acid (IAA) là dạng auxin, là chất điều hòa sinh trưởng của thực vật. IAA chi phối sự phân chia tế bào, sự giãn dài tế bào, phân hóa sinh
mô, phát triển trái và hạt và chi phối giai đoạn đầu sự phát triển của cây trồng. Tác động của IAA phụ thuộc vào dạng tế bào, ở các nồng độ khác nhau tùy thuộc vào loại phân sinh mô, IAA kích thích đồng thời sự giãn dài trục lá mầm, ngăn cản sự sinh trưởng của rễ chính, kích thích sự khởi đầu của rễ bên và sự thành lập lông rễ (Theologies and Ray, 1982). Theo Sergeeva et al., (2002), các nhóm vi khuẩn khác nhau kể cả vi khuẩn đất, vi khuẩn biểu sinh, vi sinh vật nội sinh và một số vi khuẩn lam (Cyanobacteria) đã được phát hiện là có khả năng sinh tổng hợp indole-3-acid acetic từ tiền chất L-tryptophan (Trp). Một số loài của các chi Azospirillum, Gluconacetobacter và Pseudomonas là những vi khuẩn cố định đạm nhưng nhờ vào khả năng tổng hợp IAA của chúng nên cũng được xem là vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng thực vật, góp phần làm tăng sản lượng cây trồng (Kloepper et al., 1989).
Có 3 lộ trình tiêu biểu nhất cho sự biến đổi của L-tryptophan thành IAA đã được Koga et al., (1991) mô tả chi tiết như sau:
Lộ trình indole-3-pyruvic acid :
Tryptophan indole-3-pyruvic acid indole-3-acetaldehyde IAA Lộ trình tryptamine
Tryptophan tryptamine indole-3-acetaldehyde IAA Lộ trình indole-3-acetamide
Tryptophan indole-3-acetamide IAA
Carređo-López et al., (2000) cũng nhận thấy trong các lộ trình tổng hợp IAA ở loài Azospirillum brasilense thì lộ trình indole-3-pyruvic acid vẫn là con đường chủ yếu để tổng hợp IAA từ tiền chất tryptophan và được xúc tác chủ yếu bởi enzyme indole pyruvic decarboxylase (Costacurta et al., 1994).
2.2.5. Khả năng kháng bệnh hại cây trồng
Nhiều loại vi sinh vật có khả năng kháng bệnh hại cây trồng bởi một số cơ chế sau:
Cơ chế do kháng sinh
Kháng sinh là một chất quan trọng sinh ra trong quá trình sinh trưởng của vi sinh vật để tiêu diệt những mầm bệnh có trong đất, giúp cây trồng phát triển. Nó có khả năng tiêu diệt vi khuẩn hay kìm hãm sự sinh trưởng của vi khuẩn một cách đặc hiệu (Lê Thị Thanh Thủy, 2014).
Cơ chế do siderophore
Vi sinh vật đối kháng có khả năng cạnh tranh trực tiếp với nguồn bệnh về dinh dưỡng, oxy, không gian sống, sinh kháng sinh, tạo siderophore...v...v... để sinh trưởng. Trong đó, siderophore là một loại protein sinh ra trong quá trình sinh trưởng của vi sinh vật, nó có khả năng hấp thụ các ion Fe+3 trong môi trường với ái lực cao nhằm phục vụ trực tiếp cho sự sinh trưởng và hô hấp của vi sinh vật, làm cho môi trường xung quanh nghèo sắt, dẫn đến các loại vi sinh vật khác không có đủ ion Fe+3 cho quá trình sinh trưởng của mình, do đó chúng sẽ không sinh trưởng được (Lê Thị Thanh Thủy, 2014).
Cơ chế tăng cường sức đề kháng của cây
Tác dụng của vi sinh vật kích thích sinh trưởng thực vật: Vi khuẩn kích thích sinh trưởng thực vật (Plant Growth-Promoting Bacteria – PGPB) là vi khuẩn vùng rễ khi tương tác với rễ cây có thể tạo ra tính kháng của cây chống lại vi khuẩn, nấm và virut gây bệnh. Hiện tượng này được gọi là tính kích kháng hệ thống - ISR (Induced Systemic Resistance), cũng giống như tính kích kháng hệ thống có điều kiện - SAR (Systemic Acquired Resistance) (Ryu, C. M. et al., 2004).
2.3. TỔNG QUAN VỀ VI SINH VẬT NỘI SINH VÀ CHẾ PHẨM SINH HỌC 2.3.1 Tổng quan về vi sinh vật nội sinh 2.3.1 Tổng quan về vi sinh vật nội sinh
Vi sinh vật nội sinh có thể được hiểu là các vi khuẩn tập trung trong mô thực vật mà không gây bệnh hoặc những hậu quả tiêu cực khác đối với cây chủ (Schulz and Boyle, 2005). Vi sinh vật nội sinh trải qua phần lớn vòng đời trong cây chủ (Quispel, 1992). Có hơn 300.000 loài thực vật được biết trên Trái đất mà hầu hết mỗi loài đều có một hay một số loài vi khuẩn sống nội sinh (Strobel et al., 2004). Tuy nhiên chỉ một số ít cây trồng được nghiên cứu tường tận vì hiệu quả kinh tế của chúng và qua đó tìm thấy nhiều loài vi sinh vật nội sinh với các đặc tính tốt (Ryan et al., 2008). Theo Hallmann (2001), vi sinh vật nội sinh thường được thu hút đến cây chủ bằng cơ chế hóa hướng động (chemotaxis) hay di chuyển ngẫu nhiên. Rễ cây tiết ra một số hợp chất thu hút vi sinh vật nội sinh đến và quần tụ (colonization) trên bề mặt rễ (Bashan, 1986).
Sự xâm nhập của vi sinh vật nội sinh vào mô thực vật có thể diễn ra qua các con đường sau: Qua các lỗ tự nhiên như thủy khổng, khí khổng, bì khổng; qua vi lỗ hiện diện khi bắt đầu sự hình thành lông hút; qua vị trí hình thành các rễ
ngang (lateral root) hay qua các vết thương do tác động vật lý hoặc qua các vết bệnh. Sau khi xâm nhập vào cây chủ, các vi sinh vật nội sinh có thể tập trung tại vị trí xâm nhập hay di chuyển khắp nơi trong cây đến các tế bào bên trong, vào các khoảng trống gian bào hay vào trong hệ mạch (Zinniel et al., 2002). Mật độ của quần thể vi sinh vật nội sinh rất biến động, phụ thuộc chủ yếu vào loài vi khuẩn và kiểu di truyền của cây chủ nhưng cũng phụ thuộc vào giai đoạn phát triển của cây chủ và các điều kiện môi trường (Pillay và Nowak, 1997). Vi sinh vật nội sinh giúp tăng cường dinh dưỡng cho cây bằng nhiều cơ chế trực tiếp hay gián tiếp. Nhiều vi sinh vật nội sinh có khả năng cố định đạm, có vai trò quan trọng trong vòng tuần hoàn nitrogen, bổ sung nguồn đạm cho đất và cây trồng, ổn định năng suất cây trồng và giúp phát triển sinh thái bền vững (Persello Cartieaux et al., 2003).
Vi khuẩn Azospirillum
Vi khuẩn Azospirillum thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, có khả năng chuyển động và có dạng hình que ngắn, kích thước biến động trong khoảng 0,8 - 1,7m chiều rộng và 1,4 - 3,7m chiều dài. Các loài Azospirillum phân bố rộng và gắn liền với sự đa dạng của cây trồng (Seshadri et al., 2000).
Trong những năm 1984 - 1985, người ta đã phát hiện nhiều loài của chi Azospirillum trong vùng rễ của cỏ Kallar (Leptochloa fusca) (Reinhold et al.,
1986), trong đó các vi khuẩn xâm nhập vào nhu mô rễ có khả năng cố định đạm, hòa tan lân ở dạng khó tan và các chất dinh dưỡng khác (Seshadri et al., 2000), sản xuất chất điều hòa sinh trưởng thực vật (Vande et al., 1999) hay kiểm soát các vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng (Rangaraijan et al., 2003). Okon và Labandera-Gonzalez (1994) thử nghiệm ngoài đồng các cây trồng được bổ sung với Azospirillum đã nhận thấy sản lượng cây trồng tăng 5 - 30%, cao hơn so với khi sử dụng phân hóa học.
Vi khuẩn Azotobacter
Döbereiner (1974) phân lập được loài Azotobacter paspali từ các cây cỏ đang sinh trưởng trước phòng thí nghiệm của bà. Sự khám phá ra vi khuẩn A. paspali là một bước quan trọng trong sự cố định đạm cộng sinh. Đây là loài đặc hiệu cho cỏ Paspalum notatum và khoai lang.
Vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus
Vào năm 1988, Cavalcante và Döbereiner đã phân lập được G. diazotrophicus từ rễ, thân và lá mía trồng ở Brazil, chúng hiện diện trong các
khoảng trống gian bào của tế bào nhu mô và được xem là vi sinh vật nội sinh bắt buộc. Vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus thuộc họ Acetobacteraceae là những vi khuẩn Gram âm, vi hiếu khí bắt buộc, tế bào hình que và không có nội bào tử (Muthukumarasamy et al., 2002). Vi khuẩn này có ở nhiều loại cây hòa thảo khác nhau như bắp, lúa hoang, cỏ voi, khóm, cà rốt, củ cải đường, cải bắp và cây cà phê với các đặc tính ưu việt như có khả năng cố định đạm, tổng hợp cả IAA, gibberellin và hòa tan lân khó tan (Muthukumarasamy et al., 2002; Madhaiyan et al., 2004).
Vi khuẩn Herbaspirillum
Vi khuẩn Herbaspirillum thuộc nhóm - Proteobacteria là vi khuẩn vi hiếu khí, vi khuẩn cố định đạm sống trong rễ của nhiều cây không phải là họ đậu, bao gồm các loại cây họ hòa bản có giá trị kinh tế. Hai loài Herbaspirillum seropedicae và Herbaspirillum rubrisubalbicans đã được tìm thấy ở cây bắp, mía đường, lúa hoang và lúa trồng (Baldani et al., 1986). Vi khuẩn này cũng được tìm thấy ở cỏ chăn nuôi và các cây trồng nhiệt đới như khóm và chuối (Cruz et al., 2001). Trong vùng rễ, chúng có khả năng cố định đạm mạnh mẽ (Baldani et al., 1986), ngoài ra chúng còn di chuyển đến cả những vùng ở thân và lá (Barraquio et al., 1997).
Vi khuẩn Klebsiella
Vi khuẩn Klebsiella thuộc nhóm - Proteobacteria (Gram âm), có dạng hình que, không hay ít chuyển động, kết nang, sống kỵ khí không bắt buộc. Có 2 loài quan trọng là Klebsiella pneumoniae và K. oxytoca. Vi khuẩn Klebsiella
thường xuất hiện tự nhiên trong đất, một số xâm nhập vào cây trồng và sống nội sinh trong cây. Có khoảng 30% các dòng của 2 loài này có thể cố định đạm trong các điều kiện kỵ khí. Sau đó, các nhà nghiên cứu sử dụng vi khuẩn K. oxytoca dòng GR-3 bổ sung cho giống lúa Malviyadhan-36 thì nhận thấy vi khuẩn này giúp gia tăng toàn bộ chiều dài cây và tăng hàm lượng chlorophyll-a có hiệu quả, đồng thời chúng còn kích thích sự thành lập rễ bên và rễ bất định cho cây (Iniguez et al., 2004).
Vi khuẩn Enterobacter
Vi khuẩn Enterobacter cũng thuộc nhóm - Proteobacteria (vi khuẩn Gram âm), có dạng hình que, sống kỵ khí không bắt buộc. Một số loài của vi khuẩn này sống ở vùng rễ hay nội sinh bên trong các mô thực vật có khả năng cố định đạm,
là vi khuẩn kích thích sự sinh trưởng thực vật. Hwangbo et al. (2003) đã phân lập được loài Enterobacter intermedium từ vùng rễ của một số cây cỏ ở Hàn Quốc, chúng có khả năng hòa tan các dạng lân khó tan để cung cấp cho cây theo cơ chế acid hóa bằng cách sản xuất hợp chất 2- ketogluconic acid.
Vi khuẩn Azoarcus
Bilal et al., (1987) đã phân lập được một số loại vi khuẩn Azoarcus sống trong cỏ Kallar khi người ta phát hiện lúa mì sống trong vùng trước đây có cỏ thì có năng suất cao mà không cần bón nhiều phân hóa học. Vi khuẩn này còn được phân lập từ rễ lúa, có tác dụng kích thích sự sinh trưởng của lúa. Ở những nơi trong vùng rễ có hàm lượng oxy thấp, vi khuẩn này có khả năng cố định đạm tốt (Malik et al., 1997).
Vi khuẩn Pseudomonas
Vi khuẩn Pseudomonas spp. phân bố rộng rãi và có nhiều loài, là vi khuẩn sống tự do, chúng được tìm thấy khắp nơi trong đất, nước, thực vật và động vật. Vi khuẩn Pseudomonas là vi khuẩn Gram âm, hình que, có tiên mao ở cực, không có khả năng tạo nội bào tử. Chi Pseudomonas spp. có nhiều loài có khả năng cố định đạm như Pseudomonas diminuta, P. fluorescens, P. paucimobilis, P. pseudoflava, P. putida, P. stutzeri và P. vesicularis (Chan et al., 1994). Một số dòng vi khuẩn Pseudomonas có khả năng hòa tan lân như P. fluorescens, P. putida, P. chlororaphis (Cattenlla et al., 1999). Một số loài thuộc chi
Pseudomonas như: P. putida, P. fluorescens, P. syringae có khả năng tổng hợp chất điều hòa sinh trưởng thực vật như IAA, cytokinin kích thích sự sinh trưởng của bộ rễ cây và làm tăng khả năng hấp thụ chất dinh dưỡng trong đất (Glickmann et al., 1998), một số có khả năng kháng lại một số vi sinh vật gây hại cây trồng. Nhiều loài Pseudomonas được tìm thấy nội sinh trong nhiều loài thực vật như bông vải, đậu nành, cà phê, lúa hoang và lúa trồng (Koomnok et al.,
2007) và khoai lang (Khan and Doty, 2009).
Vi khuẩn Burkholderia
Vi khuẩn Burkholderia là vi khuẩn Gram âm, dạng que ngắn, chúng có thể di chuyển nhờ tiên mao ở đầu. Chúng sinh trưởng và phát triển trong điều kiện kỵ khí hoặc hiếu khí, trong môi trường ít khí oxy thì phát triển mạnh. Vi