2.3.1 Tổng quan về vi sinh vật nội sinh
Vi sinh vật nội sinh có thể được hiểu là các vi khuẩn tập trung trong mô thực vật mà không gây bệnh hoặc những hậu quả tiêu cực khác đối với cây chủ (Schulz and Boyle, 2005). Vi sinh vật nội sinh trải qua phần lớn vòng đời trong cây chủ (Quispel, 1992). Có hơn 300.000 loài thực vật được biết trên Trái đất mà hầu hết mỗi loài đều có một hay một số loài vi khuẩn sống nội sinh (Strobel et al., 2004). Tuy nhiên chỉ một số ít cây trồng được nghiên cứu tường tận vì hiệu quả kinh tế của chúng và qua đó tìm thấy nhiều loài vi sinh vật nội sinh với các đặc tính tốt (Ryan et al., 2008). Theo Hallmann (2001), vi sinh vật nội sinh thường được thu hút đến cây chủ bằng cơ chế hóa hướng động (chemotaxis) hay di chuyển ngẫu nhiên. Rễ cây tiết ra một số hợp chất thu hút vi sinh vật nội sinh đến và quần tụ (colonization) trên bề mặt rễ (Bashan, 1986).
Sự xâm nhập của vi sinh vật nội sinh vào mô thực vật có thể diễn ra qua các con đường sau: Qua các lỗ tự nhiên như thủy khổng, khí khổng, bì khổng; qua vi lỗ hiện diện khi bắt đầu sự hình thành lông hút; qua vị trí hình thành các rễ
ngang (lateral root) hay qua các vết thương do tác động vật lý hoặc qua các vết bệnh. Sau khi xâm nhập vào cây chủ, các vi sinh vật nội sinh có thể tập trung tại vị trí xâm nhập hay di chuyển khắp nơi trong cây đến các tế bào bên trong, vào các khoảng trống gian bào hay vào trong hệ mạch (Zinniel et al., 2002). Mật độ của quần thể vi sinh vật nội sinh rất biến động, phụ thuộc chủ yếu vào loài vi khuẩn và kiểu di truyền của cây chủ nhưng cũng phụ thuộc vào giai đoạn phát triển của cây chủ và các điều kiện môi trường (Pillay và Nowak, 1997). Vi sinh vật nội sinh giúp tăng cường dinh dưỡng cho cây bằng nhiều cơ chế trực tiếp hay gián tiếp. Nhiều vi sinh vật nội sinh có khả năng cố định đạm, có vai trò quan trọng trong vòng tuần hoàn nitrogen, bổ sung nguồn đạm cho đất và cây trồng, ổn định năng suất cây trồng và giúp phát triển sinh thái bền vững (Persello Cartieaux et al., 2003).
Vi khuẩn Azospirillum
Vi khuẩn Azospirillum thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, có khả năng chuyển động và có dạng hình que ngắn, kích thước biến động trong khoảng 0,8 - 1,7m chiều rộng và 1,4 - 3,7m chiều dài. Các loài Azospirillum phân bố rộng và gắn liền với sự đa dạng của cây trồng (Seshadri et al., 2000).
Trong những năm 1984 - 1985, người ta đã phát hiện nhiều loài của chi Azospirillum trong vùng rễ của cỏ Kallar (Leptochloa fusca) (Reinhold et al.,
1986), trong đó các vi khuẩn xâm nhập vào nhu mô rễ có khả năng cố định đạm, hòa tan lân ở dạng khó tan và các chất dinh dưỡng khác (Seshadri et al., 2000), sản xuất chất điều hòa sinh trưởng thực vật (Vande et al., 1999) hay kiểm soát các vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng (Rangaraijan et al., 2003). Okon và Labandera-Gonzalez (1994) thử nghiệm ngoài đồng các cây trồng được bổ sung với Azospirillum đã nhận thấy sản lượng cây trồng tăng 5 - 30%, cao hơn so với khi sử dụng phân hóa học.
Vi khuẩn Azotobacter
Döbereiner (1974) phân lập được loài Azotobacter paspali từ các cây cỏ đang sinh trưởng trước phòng thí nghiệm của bà. Sự khám phá ra vi khuẩn A. paspali là một bước quan trọng trong sự cố định đạm cộng sinh. Đây là loài đặc hiệu cho cỏ Paspalum notatum và khoai lang.
Vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus
Vào năm 1988, Cavalcante và Döbereiner đã phân lập được G. diazotrophicus từ rễ, thân và lá mía trồng ở Brazil, chúng hiện diện trong các
khoảng trống gian bào của tế bào nhu mô và được xem là vi sinh vật nội sinh bắt buộc. Vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus thuộc họ Acetobacteraceae là những vi khuẩn Gram âm, vi hiếu khí bắt buộc, tế bào hình que và không có nội bào tử (Muthukumarasamy et al., 2002). Vi khuẩn này có ở nhiều loại cây hòa thảo khác nhau như bắp, lúa hoang, cỏ voi, khóm, cà rốt, củ cải đường, cải bắp và cây cà phê với các đặc tính ưu việt như có khả năng cố định đạm, tổng hợp cả IAA, gibberellin và hòa tan lân khó tan (Muthukumarasamy et al., 2002; Madhaiyan et al., 2004).
Vi khuẩn Herbaspirillum
Vi khuẩn Herbaspirillum thuộc nhóm - Proteobacteria là vi khuẩn vi hiếu khí, vi khuẩn cố định đạm sống trong rễ của nhiều cây không phải là họ đậu, bao gồm các loại cây họ hòa bản có giá trị kinh tế. Hai loài Herbaspirillum seropedicae và Herbaspirillum rubrisubalbicans đã được tìm thấy ở cây bắp, mía đường, lúa hoang và lúa trồng (Baldani et al., 1986). Vi khuẩn này cũng được tìm thấy ở cỏ chăn nuôi và các cây trồng nhiệt đới như khóm và chuối (Cruz et al., 2001). Trong vùng rễ, chúng có khả năng cố định đạm mạnh mẽ (Baldani et al., 1986), ngoài ra chúng còn di chuyển đến cả những vùng ở thân và lá (Barraquio et al., 1997).
Vi khuẩn Klebsiella
Vi khuẩn Klebsiella thuộc nhóm - Proteobacteria (Gram âm), có dạng hình que, không hay ít chuyển động, kết nang, sống kỵ khí không bắt buộc. Có 2 loài quan trọng là Klebsiella pneumoniae và K. oxytoca. Vi khuẩn Klebsiella
thường xuất hiện tự nhiên trong đất, một số xâm nhập vào cây trồng và sống nội sinh trong cây. Có khoảng 30% các dòng của 2 loài này có thể cố định đạm trong các điều kiện kỵ khí. Sau đó, các nhà nghiên cứu sử dụng vi khuẩn K. oxytoca dòng GR-3 bổ sung cho giống lúa Malviyadhan-36 thì nhận thấy vi khuẩn này giúp gia tăng toàn bộ chiều dài cây và tăng hàm lượng chlorophyll-a có hiệu quả, đồng thời chúng còn kích thích sự thành lập rễ bên và rễ bất định cho cây (Iniguez et al., 2004).
Vi khuẩn Enterobacter
Vi khuẩn Enterobacter cũng thuộc nhóm - Proteobacteria (vi khuẩn Gram âm), có dạng hình que, sống kỵ khí không bắt buộc. Một số loài của vi khuẩn này sống ở vùng rễ hay nội sinh bên trong các mô thực vật có khả năng cố định đạm,
là vi khuẩn kích thích sự sinh trưởng thực vật. Hwangbo et al. (2003) đã phân lập được loài Enterobacter intermedium từ vùng rễ của một số cây cỏ ở Hàn Quốc, chúng có khả năng hòa tan các dạng lân khó tan để cung cấp cho cây theo cơ chế acid hóa bằng cách sản xuất hợp chất 2- ketogluconic acid.
Vi khuẩn Azoarcus
Bilal et al., (1987) đã phân lập được một số loại vi khuẩn Azoarcus sống trong cỏ Kallar khi người ta phát hiện lúa mì sống trong vùng trước đây có cỏ thì có năng suất cao mà không cần bón nhiều phân hóa học. Vi khuẩn này còn được phân lập từ rễ lúa, có tác dụng kích thích sự sinh trưởng của lúa. Ở những nơi trong vùng rễ có hàm lượng oxy thấp, vi khuẩn này có khả năng cố định đạm tốt (Malik et al., 1997).
Vi khuẩn Pseudomonas
Vi khuẩn Pseudomonas spp. phân bố rộng rãi và có nhiều loài, là vi khuẩn sống tự do, chúng được tìm thấy khắp nơi trong đất, nước, thực vật và động vật. Vi khuẩn Pseudomonas là vi khuẩn Gram âm, hình que, có tiên mao ở cực, không có khả năng tạo nội bào tử. Chi Pseudomonas spp. có nhiều loài có khả năng cố định đạm như Pseudomonas diminuta, P. fluorescens, P. paucimobilis, P. pseudoflava, P. putida, P. stutzeri và P. vesicularis (Chan et al., 1994). Một số dòng vi khuẩn Pseudomonas có khả năng hòa tan lân như P. fluorescens, P. putida, P. chlororaphis (Cattenlla et al., 1999). Một số loài thuộc chi
Pseudomonas như: P. putida, P. fluorescens, P. syringae có khả năng tổng hợp chất điều hòa sinh trưởng thực vật như IAA, cytokinin kích thích sự sinh trưởng của bộ rễ cây và làm tăng khả năng hấp thụ chất dinh dưỡng trong đất (Glickmann et al., 1998), một số có khả năng kháng lại một số vi sinh vật gây hại cây trồng. Nhiều loài Pseudomonas được tìm thấy nội sinh trong nhiều loài thực vật như bông vải, đậu nành, cà phê, lúa hoang và lúa trồng (Koomnok et al.,
2007) và khoai lang (Khan and Doty, 2009).
Vi khuẩn Burkholderia
Vi khuẩn Burkholderia là vi khuẩn Gram âm, dạng que ngắn, chúng có thể di chuyển nhờ tiên mao ở đầu. Chúng sinh trưởng và phát triển trong điều kiện kỵ khí hoặc hiếu khí, trong môi trường ít khí oxy thì phát triển mạnh. Vi khuẩn này có khả năng cố định đạm và tạo nốt sần trong những cây họ đậu vùng nhiệt đới (Mounlin et al., 2001). Vi khuẩn Burkholderia sống cộng sinh
với cây trồng và có khả năng cố định đạm, kích thích sự sinh trưởng của cây trồng, hiện diện vùng rễ và rễ của nhiều loài cây như bắp, mía và cà phê (Scarpella et al., 2003).
Trong số 40 loài thuộc chi Burkholderia, có nhiều loài có khả năng cố định đạm như Burkholderia vietnamiensis, B. brasilensis, B. kururiensis, B. tuberum, B. phymatum, B. unamae, B. tropicalis và B. terrae (Goris et al., 2004). Vi khuẩn
B. tropicalis được tìm thấy trong cây khóm (Trần Thanh Phong và Cao Ngọc Điệp, 2012). Loài B. vietnamiensis tìm thấy trong rễ lúa trồng ở miền Nam Việt Nam. Thí nghiệm ở lúa cho thấy loài B. vietnamiensis sau 14 ngày bổ sung giúp tăng khả năng đâm chồi 33%, số lượng rễ tăng 57%, bề mặt lá tăng 30% và năng suất lúa tăng 13 - 22% (Van et al., 1994).
2.3.2. Tổng quan về chế phẩm sinh học
Chế phẩm sinh học là tập hợp các loài vi sinh vật gồm: Vi khuẩn quang hợp, vi khuẩn Lactic, nấm men, xạ khuẩn, nấm mốc sống cộng sinh trong cùng môi trường. Chế phẩm sinh học là những sản phẩm an toàn với môi trường, con người, vật nuôi, cây trồng và không gây hại và tác dụng phụ xấu khi sử dụng (Trần Thanh Loan, 2012).
Chế phẩm sinh học dùng trong nông nghiệp có những ưu điểm nổi trội so với các chế phẩm hóa chất. Chế phẩm sinh học không gây ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe con người, vật nuôi, cây trồng như thuốc bảo vệ thực vật từ hóa chất. Chế phẩm sinh học giúp cân bằng hệ sinh thái trong môi trường đất nói riêng và môi trường nói chung. Ví dụ như phân hữu cơ vừa tăng dinh dưỡng cho đất, vừa tạo điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật đất hoạt động. Sử dụng chế phẩm sinh học không những không làm thoái hóa đất mà còn góp phần tăng độ phì nhiêu của đất. Chế phẩm sinh học giúp cây trồng hấp thu chất dinh dưỡng dễ hơn, góp phần tăng năng suất và chất lượng nông phẩm. Các loại chế phẩm sinh học còn có tác dụng tiêu diệt côn trùng gây hại, giảm thiểu bệnh hại, tăng khả năng đề kháng bệnh của cây trồng mà không làmảnh hưởng đến môi trường như các loại thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa chất. Tác dụng của chế phẩm sinh học đến từ từ chứ không nhanh như các loại hóa chất nhưng tác dụng dài lâu. Một ưu điểm nữa của chế phẩm sinh học là khả năng phân hủy, chuyển hóa các phế thải sinh học, phế thải nông nghiệp, công nghiệp góp phần làm sạch môi trường (Minh Long, 2012).
Các chế phẩm sinh học dùng trong nông nghiệp có thể được chia làm bốn nhóm như sau:
Nhóm chế phẩm sinh học ứng dụng cho việc phòng trừ dịch hại trên cây trồng.
Thực chất đây là thuốc BVTV nguồn gốc sinh học có thể tiêu diệt hoặc phòng trừ dịch hại. Dịch hại là các sinh vật, vi sinh vật, các loại sâu hại, các loài gậm nhấm, có khả năng gây hại cho cây trồng và lương thực.
Nhóm chế phẩm sinh học dùng cho sản xuất phân bón hữu cơ sinh học, phân bón vi sinh.
Phân vi sinh là loại phân có chứa hàm lượng vi sinh vật có ích cao (≥1x108CFU/g), thường không có hàm lượng chất dinh dưỡng kèm theo. Phân vi sinh được sản xuất và bón vào đất nhằm tăng lượng vi sinh vật có ích cho cây trồng, đặc biệt đối với vi sinh vật cố định đạm.
Phân hữu cơ sinh học là sản phẩm phân bón được tạo qua quá trình lên men vi sinh vật các hợp chất hữu cơ có nguồn gốc khác nhau và chuyển hóa thành mùn. Không có yêu cầu chủng vi sinh phải đạt là bao nhiêu.
Phân hữu cơ vi sinh là loại phân bón được sản xuất từ nguyên liệu hữu cơ, có chứa ít nhất một chủng vi sinh vật có ích phù hợp với hàm lượng cao (≥1x106CFU/g) (Bùi Thị Hiền, 2014).
Nhóm chế phẩm sinh học dùng cho cải tạo đất và xử lý phế thải nông nghiệp.
Là các loại chế phẩm có nguồn gốc sinh học được đưa vào đất để cải tạo lý hóa tính của đất (kết cấu đất, độ ẩm, hữu cơ, khả năng giữ nước, pH…), hoặc giải phóng đất khỏi những yếu tố bất lợi khác (kim loại nặng, vi sinh vật, hóa chất độc hại …) làm cho đất trở nên tốt hơn để sử dụng làm đất trồng cây.
Nhóm điều hòa sinh trưởng cây trồng (hooc mon tăng trưởng).
Ở Việt Nam, hooc mon tăng trưởng được xếp vào danh mục thuốc BVTV, chia thành hai nhóm nhỏ:
- Nhóm các chất kích thích sinh trưởng: các chất có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát triển của cây. Hàm lượng các chất này được quy định chặt chẽ.
- Nhóm các chất ức chế sinh trưởng: các chất có tác dụng kìm hãm, ức chế sinh trưởng và phát triển của cây như làm lùn, làm chín, làm rụng lá…(Minh Long, 2012).
2.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SỬ DỤNG VI SINH VẬT NỘI SINH VÀ CHẾ PHẨM SINH HỌC TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM
2.4.1. Tình hình nghiên cứu sử dụng VSV nội sinh và chế phẩm sinh học trên Thế giới trên Thế giới
Có rất nhiều các công trình nghiên cứu sử dụng các tác nhân phòng trừ sinh học hệ rễ cho thấy rằng 5 trong số 6 vi khuẩn hệ rễ cảm ứng kháng hệ thống ở dưa chuột có khả năng tạo dòng rễ cả trong và ngoài. Vi khuẩn nội sinh có hoạt tính đối kháng chống lại một số mầm bệnh thực vật như Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicum, tác nhân gây bệnh thối vòng trên khoai tây (Van Buren AM. et al., 1993) và P. fluorescens 89B-27 và Serratia marcescens 90-166 cảm ứng kháng với P. syringae pv. lachrymans, Fusarium oxyporum
f.sp. cucumerium và Colletrotrichum orbiculare (Liu L. et al., 1995). Ứng dụng vi khuẩn nội sinh vào cây bông bằng tiêm cành làm giảm thối rễ gây ra bởi
Rhizoctonia solani và héo mạch gây ra bởi F. oxysporum f.sp. vasinfectum
(Chen C. et al., 1994). Xử lý hạt cà chua với chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus pumilus SE4 cản trở đường vào của nấm bệnh gây héo mạch F. oxysporum f.sp. radicislycospersici và sự sinh trưởng của khuẩn ty chỉ hạn chế ở biểu bì và bao rễ ngoài. Ứng dụng chủng P. fluorescens 63-28 hạn chế sự sinh trưởng của
Pythium ultimum ở đậu và F. oxysporum f.sp.radici-lycopersici ở cà chua. Chủng Pseudomonas fluorescent (CCA90) có thể tạo dòng cả bên trong và bên ngoài mô rễ và cành. Và các chủng vi khuẩn nội sinh phân lập từ cây sồi có hoạt tính sinh học chống lại mầm bệnh gây héo sồi Ceratocystis fagacearum
(Brooks DS. et al., 1994).
Hiện nay, các nước trên thế giới đang quan tâm đến việc sử dụng phân hữu cơ như phân chuồng, phân ủ, phân xanh...
Ấn Độ hàng năm sản xuất 286 triệu tấn phân ủ compost từ chất thải nông thôn và thành phố, ước tính thu được 3,5- 4,0 triệu tấn NPK (Lê Văn Tri, 2001). Sử dụng phân VSV cho lúa, cao lương, bông làm tăng năng suất trung bình 11,4; 18,2 và 6,8triệu tấn/ha mang lại lợi nhuận khoảng 1,105; 1,149; 3,43 rupi/ha (Lê Văn Tri, 2004).
Hiện nay, Trung Quốc, Ấn Độ là hai quốc gia đang đẩy mạnh chương trình phát triển ứng dụng công nghệ sản xuất lân vi sinh ở quy mô lớn với diện tích sử dụng hàng chục ha. Trung Quốc sử dụng phân hữu cơ vi sinh từ nguồn
rơm rạ, phân xanh, khô dầu ước tính tương đương 65 kg (N + P2O5 + K2O) (Lê Văn Tri, 2001).
Các kết quả nghiên cứu từ Canada, Ấn độ, Thái Lan, Trung Quốc, Nhật Bản cho thấy sử dụng phân bón hữu cơ vi sinh có thể cung cấp cho cây trồng 30- 60 kg/ha/năm hoặc thay quặng phốt phát ngoài ra thông qua các hoạt động sống của VSV cây trồng được nâng cao khả năng trao đổi chất khả năng chống chịu bệnh và qua đó góp phần nâng cao chất lượng nông sản (Nguyễn Thị Lẫm, 1999). Chế phẩm VSV có thể sử dụng như phân bón hoặc phối trộn với phân hữu cơ tạo thành phân bón hữu cơ VSV.
Trong những năm gần đây, việc nghiên cứu và sản xuất ra chế phẩm sinh học, hữu cơ chức năng được đẩy mạnh để dần thay thế phân bón hóa học và thuốc trừ sâu bệnh có nguồn gốc hóa học đã được hầu hết các nước quan tâm và