Phần 3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.1. Tuyển chọn giống vi sinh vật theo phương pháp đánh giá trực tiếp đặc
các điều kiện khác nhau
3.5.1.1. Xác định khả năng phân giải xenlulozo và tinh bột theo phương pháp khuếch tán phóng xạ trên đĩa thạch
Nuôi dịch chiết: Nuôi cấy VSV trên 9ml dung dịch môi trường chuyên tính với 1 vòng que cấy chứa VSV, đưa lên máy lắc ở 150 vòng/phút. Sau 72 giờ dịch nuôi cấy được đánh giá khả năng phân giải enzym.
Chuẩn bị môi trường:
Enzym Xenlulozo Amylaza
Hóa chất CMC Thạch Tinh bột Thạch
Tỷ lệ 0,2% 1,5% 0,2% 1,5%
Màu Vàng Tím
Đường kính D = D – d (mm)
Môi trường đem hấp ở 1210C, áp suất 1 atm trong vòng 20 phút, đổ ra đĩa petri với lượng môi trường dày 2mm và để nguội. Dùng miệng ống nghiệm đã khử trùng đục 3 lỗ trên 1 đĩa thạch với đường kính 12mm.
Nhỏ dịch: Hút 0,2ml dịch thể nhỏ vào các lỗ thạch đã đục. Đặt đĩa petri trong tủ lạnh 6 giờ để enzym khuếch tán trên đĩa thạch, sau đó đặt vào tủ nuôi ở 28oC trong 48 giờ rồi đem nhuộm màu bằng dung dịch lugol, sau khi xuất hiện vòng phân giải đem đo đường kính và khả năng phân gải được tính bằng hiệu giữa đường kính vòng phân giải và đường kính lỗ thạch.
3.5.1.2. Xác định khả năng phân giải lân
Nuôi dịch chiết: Nuôi cấy VSV trên 9ml dung dịch môi trường chuyên tính với 1 vòng que cấy chứa VSV, đưa lên máy lắc ở 150 vòng/phút. Sau 48 giờ dịch nuôi cấy được đánh giá khả năng phân giải.Môi trường đem hấp ở 1210C, áp suất 1 atm trong vòng 20 phút, đổ ra đĩa petri với lượng môi dày 2mm và để nguội. Cấy chấm điểm dịch nuôi VSV trên môi trường Pikovaskya (phụ lục 3).
Theo dõi khả năng hình thành phòng phân giải của các chủng VSVtrong thời gian 72h.VSV có hoạt tính phân giải lân sẽ có vòng sáng halo tạo thành xung quanh khuẩn lạc, còn vùng chưa phân giải có màu đục hơn.
Khả năng phân giải lân được tính bằng hiệu giữa đường kính vòng sáng halo và đường kính khuẩn lạc VSV.
3.5.1.3. Định lượng IAA bằng phương pháp Salkowski
Vi khuẩn được nuôi trong môi trường NA bổ sung 0.1% tryptophan lắc với tốc độ 200 vòng/ phút ở nhiệt độ 300C trong 48h. Sau đó thu dịch nuôi cấy đem ly tâm với tốc độ 5500 vòng/ phút trong 5 phút.
Hút 1 ml dịch trong thu được sau ly tâm cho vào ống nghiệm chứa sẵn 2 ml thuốc thử Salkowski, đối chứng là 1 ml môi trường dịch thể đã ly tâm không nuôi VSV thêm vào 2 ml thuốc thử. Lắc đều, để trong tối 20 phút. So màu trên máy đo quang phổ ở bước sóng 530nm. Chỉ số OD được đối chiếu với đồ thị chuẩn để tính lượng IAA trong dịch nuôi cấy. Hàm lượng IAA tính theo đơn vị µg IAA/ml.
Thuốc thử Salkowski (phụ lục 4) sau khi pha xong cần bảo quan trong bình tối.
Phương pháp xây dựng đồ thị đường chuẩn
Xây dựng đường chuẩn IAA: gồm 10 bình định mức được đánh số theo thứ tự từ 0 đến 10 với ống 0 là bình đối chứng âm, hàm lượng IAA các bình theo thứ tự tăng dần là 0, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60,70, 80, 90 µg/ml IAA.
Lắc đều các bình sau đó hút từ mỗi bình 1ml dung dịch thêm vào 2 ml thuốc thử Salkowski lần lượt vào các ống nghiệm đánh số từ 0 đến 10.Lắc đều, để trong tối 20 phút. So màu trên máy đo quang phổ ở bước sóng 530nm. Chỉ số OD được dùng để xây dựng đường chuẩn.
Phương trình đường chuẩn có dạng: Y = a * X + b, trong đó X là nồng độ của mẫu (µg/ml), Y là độ hấp thụ quang(OD 530nm). Hàm lượng IAA có trong mẫu theo công thức: X = (Y-b)/a.
3.5.1.4. Đánh giá khả năng thích ứng pH và nhiệt độ
- Đánh giá khả năng thích ứng pH khác nhau: Bổ sung 10% dung dịch đệm pH (pha bằng Na2HPO4 và KH2PO4, đo và chỉnh pH của dung dịch bằng giấy quỳ) vào môi trường chuyên tính, đem hấp khử trùng và đổ vào đĩa petri, cấy VSV tương ứng và đem nuôi ở 28oC, sau đó đếm số lượng khuẩn lạc tạo thành.
- Đánh giá khả năng chịu nhiệt của các chủng VSV: Cấy VSV trên từng môi trường chuyên tính tương ứng sau đó đem nuôi ở các mức nhiệt độ khác nhau 20oC – 30oC – 35oC – 40oC, đếm số lượng khuẩn lạc tạo thành.
3.5.1.5. Xác định tính đối kháng của chủng giống VSV theo phương pháp cấy vạch
Các chủng giống được đánh giá tính đối kháng theo từng cặp theo phương pháp đường vuông góc Cross-Streak. Các chủng VSV được cấy thành cặp theo các đường giao nhau. Nếu xuất hiện vòng đối kháng (các chủng mọc cách nhau) thì các chủng đó đối kháng nhau và không thể phối trộn chúng vào cùng chất mang.