Việt Nam
Gần đây, VSV nội sinh và vai trò của chúng đã bắt đầu được các nhà khoa học trong nước quan tâm nghiên cứu. Nguyễn Thị Thu Hà và cs. (2009) đã phân lập được 7 dòng vi khuẩn nội sinh trong một số loại cỏ chăn nuôi có đặc tính cố
định đạm, phân giải lân và tổng hợp IAA cao. Vi khuẩn nội sinh trong nhóm cây khóm trên đất phèn và cây Xuyến chi đã được phân lập và nhận diện (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Ái Chi, 2009; Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Thành Dũng 2010; Lương Thị Hồng Hiệp và Cao Ngọc Điệp, 2011). Khả năng cố định đạm, hòa tan lân và sinh tổng hợp IAA của vị khuẩn vi khuẩn Azospirillium lipoferum cũng được đánh giá (Lăng Ngọc Dậu và cs., 2007; Nguyễn Thị Huỳnh Như và cs., 2013). Tuy nhiên, các nghiên cứu này mới chỉ dừng lại ở mức phân lập, nhận diện và đánh giá sơ bộ vai trò của một số loại VSV nội sinh trên cây trồng.
Nguyễn Thị Minh và cs. (2005, 2014) đã phân lập được một số loài nấm rễ nội cộng sinh Arbuscular Mycorrhizac dùng để xử lý cho cây trồng hay sản xuất vật liệu sinh học nhằm tái tạo thảm thực vật phủ xanh. Đặc tính đa mang của vi khuẩn nốt sần Rhizobia trên cây họ đậu và khả năng hiệp đồng của chúng giúp kích thích sinh trưởng của cây đã được chứng minh bởi Nguyễn Thị Minh và cs. (2009, 2010). Mặc dù một số loại VSV nội sinh trên một số thực vật đã được phân lập nhưng chưa được đưa vào ứng dụng trong thực tiễn sản xuất và chưa đáp ứng đủ nhu cầu phục vụ cho phát triển nông nghiệp hữu cơ bền vững về bảo vệ mội trường.
Phạm Quang Thu, Nguyễn Hoàng Nghĩa, Trần Xuân Hưng, Nguyễn Văn Nam (Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam) phân lập và đánh giá hiệu lực ức chế nấm gây bệnh của các chủng VSV nội sinh từ các dòng Keo tai tượng. Phân lập được 8 chủng vi khuẩn nội sinh và 13 chủng vi nấm nội sinh từ 35 dòng Keo tai tượng khảo nghiệm tại Thừa Thiên Huế, trong đó có 15 chủng gồm vi khuẩn và nấm nội sinh trên tổng số 21 chủng có hoạt tính ức chế nấm Ceratocystis sp. Ở mức độ mạnh và rất mạnh và chỉ có 8 trên tổng số 21 chủng ức chế nấm
Corticium salmonicolor ở mức độ mạnh và rất mạnh. Nguyễn Văn Minh và cs. (2014) đã sàng lọc được 21 chủng vi khuẩn nội sinh, 14 chủng nấm nội sinh có khả năng kiểm soát sinh học vi nấm Corynespora cassiicola trên cây cao su.
Phạm Quang Thu (2002) sử dụng VSV nội sinh thực vật có khả năng ức chế sự phát triển của nấm gây bệnh cây rừng đã được nghiên cứu ở Việt Nam từ năm 2002, tác giả đã đi sâu vào nghiên cứu khả năng tương tác của các VSV có khả năng ức chế sinh vật gây bệnh với các loài sinh vật đặc thù khác nhau như VSV phân giải lân, VSV kích thích sinh trưởng, VSV cố định đạm hội sinh và cộng sinh, VSV đối kháng với nấm gây bệnh...để tạo ra chế phẩm hỗn hợp được
nghiên cứu và sản xuất thử cho từng đối tượng cây trồng như: cây Bông, cây Đậu, cây Cà chua, cây Điều và một số cây khác như cây keo, cây Thông nhựa, Thông mã vĩ.
Nguyễn Thị Thu Hà và cs. (2008) đã phân lập được 71 dòng vi khuẩn khác nhau trong một số loại cỏ chăn nuôi. Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Ái Chi (2009), Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Thành Dũng (2010) phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây khóm trồng trên đất phèn huyện Bến Lức, tỉnh Long An và huyện Vĩnh Thuận, tỉnh Kiên Giang. Lương Thị Hồng Hiệp và Cao Ngọc Điệp đã phân lập và nhận diện vi khuẩn nội sinh trong cây cúc xuyến chi (Twedelia Trilobata (L.) Hitche.), có 27/37 dòng được xác định là vi khuẩn nội sinh (6 dòng phân lập trên môi trường Nfb, 10 dòng phân lập trên môi trường RMR, 11 dòng phân lập trên môi trường LGI) bằng kỹ thuật PCR 16s-rDNA.
Nguyễn Thị Huỳnh Như và cs. (Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ) đã phân lập 43 dòng vi khuẩn trên hai loại môi trường NFb và Baz có khả năng tổng hợp IAA và cố định đạm trên cây chuối.
Bên cạnh đó, nhiều đề tài nghiên cứu xử lý phế thải chăn nuôi và sản xuất phân hữu cơ và hữu cơ vi sinh bằng chế phẩm sinh học và VSV nội sinh. Chính vì vậy, các loại phân hữu cơ vi sinh và chế phẩm vi sinh hiện đang lưu hành trên thị trường chưa thực sự phát huy được hiệu quả và chưa đưa vào ứng dụng đại trà trong sản xuất nông nghiệp.
- Chế phẩm Xử lý phụ phế phẩm nông nghiệp
Chế phẩm sinh học nấm đối kháng Trichoderma ngoài tác dụng sản xuất phân bón hũu cơ sinh học, hay sử dụng như một loại thuốc BVTV thì còn có tác dụng để xử lý ủ phân chuồng, phân gia súc, vỏ cà phê, chất thải hũu cơ như rơm, rạ, rác thải hữu cơ rất hiệu quả. Chế phẩm sinh học BIMA (có chứa
Trichoderma sp.) của Trung Tâm Công nghệ Sinh học TP. Hồ Chí Minh, chế phẩm Vi-ĐK của Công ty thuốc sát trùng Việt Nam đang được nông dân TP (Trần Minh Hiền và cs., 2013).
Các chế phẩm sinh học của Viện Sinh học nhiêt đới như BIO-F, chế phẩm sinh học chứa các VSV do nhóm phân lập và tuyển chọn: xạ khuẩn
Streptomyces sp., nấm mốc Trichoderma sp. và vi khuẩn Bacillus sp…Những VSV trên trong chế phẩm sinh học có tác dụng phân huỷ nhanh các hợp chất
hữu cơ trong phân lợn, gà và bò(protein và cellulose), gây mất mùi hôi. Trước đó, chế phẩm sinh học BIO-F đã được sử dụng để sản xuất thành công phân bón hữu cơ vi sinh từ bùn đáy ao, vỏ cà phê và xử lý rác thải sinh hoạt (Trần Minh Hiền và cs., 2013).
- Chế phẩm sinh học cải tạo đất
Viện Công nghệ Sinh học (Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) đã nghiên cứu và sản xuất thành công chế phẩm sinh học giữ ẩm cho đất có tên là
Lipomycin-M. Thành phần chính là của Lipomycin-M là chủng nấm men
Lipomyces PT7.1 có khả năng tạo màng nhầy trong điều kiện đất khô hạn, giúp giảm thoát nước, duy trì độ ẩm cho đất trong điều kiện địa hình không có nước tưới thời gian dài, góp phần nâng cao tỷ lệ sống của cây trồng, hỗ trợ tốt cho việc phủ xanh đất trống đồi trọc (Trần Minh Hiền và cs., 2013).
- Chế phẩm sinh học ứng dụng phòng trừ sâu bệnh
VINEEM 1500 EC là sản phẩm của Công ty thuốc sát trùng Miền Nam, được chiết xuất từ nhân hạt Neem (Azadirachta indica A. Juss) có chứa hoạt chất Azadirachtin, có hiệu lực phòng trừ nhiều lọai sâu hại trên cây trồng như lúa, rau màu, cây công nghiệp, cây ăn trái, hoa kiểng. Bằng kỹ thuật công nghệ sinh học, các nhà khoa học Viện khoa học nông nghiệp Việt Nam đã nghiên cứu và sản xuất ra 7 loại chế phẩm thuộc nhóm thuốc trừ sâu sinh học như chế phẩm vi sinh BT (Bacciluss Thuringiensis var.) có nguồn gốc vi khuẩn, phổ diệt sâu rộng và hữu hiệu.
Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng (Đại học Cần Thơ) cũng đã nghiên cứu và đưa ra 02 chế phẩm sinh học Biobac và Biosar có khả năng phòng trừ 02 bệnh thường gặp trên lúa là đốm vằn và cháy lá (Trần Minh Hiền và cs., 2013).
Chính phủ Việt Nam đã sớm nhận thấy được vai trò quan trọng này, vì vậy từ năm 1994, Thủ tướng Chính phủ đã ra Chỉ thị số: 644/TTg ngày 5 tháng 11 năm 1994 chỉ đạo việc quản lý: sản xuất, kinh doanh và chất lượng phân bón vi sinh(Trần Minh Hiền và cs., 2013).
PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Đề tài được nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Jica, khoa Quản lý đất đai, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
3.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
- Thời gian tiến hành đề tài luận văn: Từ tháng 6/2016 đến tháng 9/2017. - Phạm vi thời gian số liệu được thu thập: Từ năm 2015 đến năm 2017.
3.3. ĐỐI TƯỢNG/VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
- Đối tượng nghiên cứu: Vi sinh vật nội sinh, chế phẩm dinh dưỡng vi sinh đa chức năng.
- Vật liệu nghiên cứu:
+ Dịch dinh dưỡng từ xử lý phế thải chăn nuôi Lợn.
+ Vi sinh vật nội sinh phân lập được từ các vùng sinh thái và trên các loại cây khác nhau.
+ Cây trồng: Rau mồng tơi (Basellaceae).
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Tuyển chọn các giống vi sinh vật nội sinh có hoạt tính sinh học cao (khả năng sinh IAA, chuyển hóa lân,...).
- Xác định điều kiện nhân sinh khối tối ưu cho các giống VSV tuyển chọn. - Chất lượng của chế phẩm dinh dưỡng vi sinh đa chức năng từ VSV nội sinh và phế thải chăn nuôi dạng lỏng.
- Đánh giá hiệu quả của chế phẩm dinh dưỡng vi sinh đa chức năng trên cây trồng.
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1. Tuyển chọn giống vi sinh vật theo phương pháp đánh giá trực tiếp đặc tính sinh học của các chủng vi sinh vật trên môi trường chuyên tính ở đặc tính sinh học của các chủng vi sinh vật trên môi trường chuyên tính ở các điều kiện khác nhau
3.5.1.1. Xác định khả năng phân giải xenlulozo và tinh bột theo phương pháp khuếch tán phóng xạ trên đĩa thạch
Nuôi dịch chiết: Nuôi cấy VSV trên 9ml dung dịch môi trường chuyên tính với 1 vòng que cấy chứa VSV, đưa lên máy lắc ở 150 vòng/phút. Sau 72 giờ dịch nuôi cấy được đánh giá khả năng phân giải enzym.
Chuẩn bị môi trường:
Enzym Xenlulozo Amylaza
Hóa chất CMC Thạch Tinh bột Thạch
Tỷ lệ 0,2% 1,5% 0,2% 1,5%
Màu Vàng Tím
Đường kính D = D – d (mm)
Môi trường đem hấp ở 1210C, áp suất 1 atm trong vòng 20 phút, đổ ra đĩa petri với lượng môi trường dày 2mm và để nguội. Dùng miệng ống nghiệm đã khử trùng đục 3 lỗ trên 1 đĩa thạch với đường kính 12mm.
Nhỏ dịch: Hút 0,2ml dịch thể nhỏ vào các lỗ thạch đã đục. Đặt đĩa petri trong tủ lạnh 6 giờ để enzym khuếch tán trên đĩa thạch, sau đó đặt vào tủ nuôi ở 28oC trong 48 giờ rồi đem nhuộm màu bằng dung dịch lugol, sau khi xuất hiện vòng phân giải đem đo đường kính và khả năng phân gải được tính bằng hiệu giữa đường kính vòng phân giải và đường kính lỗ thạch.
3.5.1.2. Xác định khả năng phân giải lân
Nuôi dịch chiết: Nuôi cấy VSV trên 9ml dung dịch môi trường chuyên tính với 1 vòng que cấy chứa VSV, đưa lên máy lắc ở 150 vòng/phút. Sau 48 giờ dịch nuôi cấy được đánh giá khả năng phân giải.Môi trường đem hấp ở 1210C, áp suất 1 atm trong vòng 20 phút, đổ ra đĩa petri với lượng môi dày 2mm và để nguội. Cấy chấm điểm dịch nuôi VSV trên môi trường Pikovaskya (phụ lục 3).
Theo dõi khả năng hình thành phòng phân giải của các chủng VSVtrong thời gian 72h.VSV có hoạt tính phân giải lân sẽ có vòng sáng halo tạo thành xung quanh khuẩn lạc, còn vùng chưa phân giải có màu đục hơn.
Khả năng phân giải lân được tính bằng hiệu giữa đường kính vòng sáng halo và đường kính khuẩn lạc VSV.
3.5.1.3. Định lượng IAA bằng phương pháp Salkowski
Vi khuẩn được nuôi trong môi trường NA bổ sung 0.1% tryptophan lắc với tốc độ 200 vòng/ phút ở nhiệt độ 300C trong 48h. Sau đó thu dịch nuôi cấy đem ly tâm với tốc độ 5500 vòng/ phút trong 5 phút.
Hút 1 ml dịch trong thu được sau ly tâm cho vào ống nghiệm chứa sẵn 2 ml thuốc thử Salkowski, đối chứng là 1 ml môi trường dịch thể đã ly tâm không nuôi VSV thêm vào 2 ml thuốc thử. Lắc đều, để trong tối 20 phút. So màu trên máy đo quang phổ ở bước sóng 530nm. Chỉ số OD được đối chiếu với đồ thị chuẩn để tính lượng IAA trong dịch nuôi cấy. Hàm lượng IAA tính theo đơn vị µg IAA/ml.
Thuốc thử Salkowski (phụ lục 4) sau khi pha xong cần bảo quan trong bình tối.
Phương pháp xây dựng đồ thị đường chuẩn
Xây dựng đường chuẩn IAA: gồm 10 bình định mức được đánh số theo thứ tự từ 0 đến 10 với ống 0 là bình đối chứng âm, hàm lượng IAA các bình theo thứ tự tăng dần là 0, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60,70, 80, 90 µg/ml IAA.
Lắc đều các bình sau đó hút từ mỗi bình 1ml dung dịch thêm vào 2 ml thuốc thử Salkowski lần lượt vào các ống nghiệm đánh số từ 0 đến 10.Lắc đều, để trong tối 20 phút. So màu trên máy đo quang phổ ở bước sóng 530nm. Chỉ số OD được dùng để xây dựng đường chuẩn.
Phương trình đường chuẩn có dạng: Y = a * X + b, trong đó X là nồng độ của mẫu (µg/ml), Y là độ hấp thụ quang(OD 530nm). Hàm lượng IAA có trong mẫu theo công thức: X = (Y-b)/a.
3.5.1.4. Đánh giá khả năng thích ứng pH và nhiệt độ
- Đánh giá khả năng thích ứng pH khác nhau: Bổ sung 10% dung dịch đệm pH (pha bằng Na2HPO4 và KH2PO4, đo và chỉnh pH của dung dịch bằng giấy quỳ) vào môi trường chuyên tính, đem hấp khử trùng và đổ vào đĩa petri, cấy VSV tương ứng và đem nuôi ở 28oC, sau đó đếm số lượng khuẩn lạc tạo thành.
- Đánh giá khả năng chịu nhiệt của các chủng VSV: Cấy VSV trên từng môi trường chuyên tính tương ứng sau đó đem nuôi ở các mức nhiệt độ khác nhau 20oC – 30oC – 35oC – 40oC, đếm số lượng khuẩn lạc tạo thành.
3.5.1.5. Xác định tính đối kháng của chủng giống VSV theo phương pháp cấy vạch
Các chủng giống được đánh giá tính đối kháng theo từng cặp theo phương pháp đường vuông góc Cross-Streak. Các chủng VSV được cấy thành cặp theo các đường giao nhau. Nếu xuất hiện vòng đối kháng (các chủng mọc cách nhau) thì các chủng đó đối kháng nhau và không thể phối trộn chúng vào cùng chất mang.
3.5.2. Xác định điều kiện nhân giống thích hợp cho các chủng VSV nội sinh được tuyển chọn được tuyển chọn
3.5.2.1 . Ảnh hưởng của pH
Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh ở các pH giá trị 5, 6, 7, 8, 9 nhằm nghiên cứu ảnh hưởng pH đến sinh trưởng và hàm lượng IAA của vi khuẩn nội sinh trên môi trường LB ở điều kiện lắc 150 vòng/phút ở 30°C, sau 48 giờ.
3.5.2.2 . Ảnh hưởng của nhiệt độ
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng và hàm lượng IAA được nghiên cứu trên môi trường LB, lắc 150 vòng/phút sau 48 giờ ở các nhiệt độ 25°C, 30°C, 35°C và 40°C.
3.5.2.3 . Ảnh hưởng của tốc độ lắc
Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến sinh trưởng và hàm lượng IAA được nghiên cứu trên môi trường LB ở các tốc độ lắc 100 vòng/phút, 150 vòng/phút, 200 vòng/phút và 250 vòng/phút , sau 48 giờ với pH và nhiệt độ thích hợp.
3.5.2.4 . Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Sinh trưởng và hàm lượng IAA của các chủng được nghiên cứu trên môi trường LB với pH, nhiệt độ và tốc độ lắc thích hợp. Chỉ số CFU và hàm lượng IAA được xác định sau các khoảng thời gian 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ.
3.5.2.5 . Ảnh hưởng của nồng độ muối
Ảnh hưởng của nồng độ muối đến sinh trưởng và hàm lượng IAA của các chủng được nghiên cứu trên môi trường LB lắc 150 vòng/phút ở 30°C sau 48 giờ ở các nồng độ muối 0,5/1/2/3/4/5%.
3.5.3. Xác định chất lượng của chế phẩm dinh dưỡng vi sinh từ phế thải chăn nuôi, tính chất đất thí nghiệm chăn nuôi, tính chất đất thí nghiệm
Phương pháp thông dụng hiện hành theo TCVN: Hàm lượng chất hữu cơ, hàm lượng các chất dinh dưỡng chính, độ ẩm, pH...
+ Xác định Nito tổng số: TCVN 6498: 1999 ISO 11261: 1995 + Xác định Photpho tổng số: TCVN 4052: 1985
+ Xác định Kali tổng: TCVN 4053:1985 + Xác định pH H2O: TCVN 4402: 1987 + Xác định độ ẩm: TCVN 1867: 2001.
3.5.4. Giống vi sinh vật và dịch dinh dưỡng sau xử lý phế thải chăn nuôi được phối trộn theo phương pháp phối trộn chất mang không thanh trùng được phối trộn theo phương pháp phối trộn chất mang không thanh trùng
Giống VSV nội sinh từ ống giống được cấy chuyển và nhân giống riêng rẽ trên môi trường chuyển thể chuyên tính trên máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 48h để tạo thành giống cấp 1. Sau kiểm tra tiếp tục nhân giống cấp 2 trên môi trường dịch thể tương ứng với tỷ lệ giống là 5%. Sau đó các giống VSV nội