Phần 3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.2. Phương pháp thực nghiệm
3.5.2.1. Phương pháp nghiên cứu xác định các điều kiện nuôi cấy tạo vi khuẩn Vibrio fischeri
Bảng 3.1. Các thành phần môi trường nuôi cấy
TT Môi trường Hóa chất Định
lượng Hóa chất
Định lượng
1 TCBS 2%
( Jairo, 2013)
nước cất 1000ml natri clorua 20g
pepton 10g natri cholat 3g
cao nấm men 5g ferric citrat 1g
natri citrat 10g saccharose 20g
natri thiosulfat 10g dung dịch xanh
thymol 1% 4ml
mật bị khơ 5g dung dịch xanh
bromothymol 0,2% 20ml agar 15g pH Chỉnh về 8,6 2 Photobacterium (Photobacterium agar, Publication No. 11040) nước cất 1000ml pepton 5g CaCl2.2H2O 1,5g KCl 0,7g MgCl2.6H2O 5,5g NaCl 28,2
MgSO4.7H2O 6,9g cao nấm men 5g
agar 15g pH Chỉnh về 7,4 3 MT K 2% (Nguyễn Thị Phương, kỹ thuật pha chế môi trường) Nước cất 1000ml cao thịt bò 4g NaCl 10g agar 20g pepton 20g pH Chỉnh về 7,6
Xác định các điều kiện nuôi cấy của V. fischeri được thực hiện dựa trên nguồn vi khuẩn đã phân lập được, tiến hành nuôi cấy trên một số loại môi trường khác nhau bao gồm môi trường nuôi cấy TCBS 2% (cải biến từ TCBS bằng cách bổ sung 2% NaCl ), môi trường Photobacterium và Môi trường nuôi cấy MT K 2% (cải biến từ môi trường Thạch Kiềm bằng cách bổ sung NaCl 2%). Công thức pha môi trường:
a. Các kĩ thuật cấy vi sinh
Các kĩ thuật cấy vi sinh cơ bản: kĩ thuật cấy hộp trải, kĩ thuật cấy zic zac và kĩ thuật cấy chuyển được tiến hành theo Vũ Thị Minh Đức, 2001.
b. Phương pháp nuôi cấy trên môi trường lỏng
Phương pháp nuôi cấy trên môi trường lỏng được tiến hành để tạo nguồn vi khuẩn tham gia các thử nghiệm tiếp theo. Phương pháp được tiến hành trên 3 môi trường TCBS 2%, Photobacterium và MT K 2% như sau:
- Hoạt hóa vi khuẩn: khuẩn lạc (từ đĩa cấy chuyển) được chọn lựa, hòa tan vào 5 ml môi trường (chứa trong ống fancol 15 ml) và được nuôi ở 26oC với tốc độ lắc 200 vịng/phút trong 23 h.
- Ni lỏng: dịch hoạt hóa vi khuẩn trên được bổ sung vào mơi trường nuôi cấy lỏng tương ứng theo tỉ lệ thể tích là 1:100 và ni ở 26oC với tốc độ lắc 200 vòng/phút trong 23 h - 51 h (tùy vào mục đích thử nghiệm). Dịch ni lỏng vi khuẩn sẽ được dùng trong các thử nghiệm tiếp theo.
c. Phương pháp xác định tốc độ sinh trưởng
Tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn được xác định dựa trên nguyên lí đo mật độ quang của dịch vi khuẩn ở bước sóng 600 nm.
Phương pháp được tiến hành theo Dedi và cộng sự, 2014; trong đó tại mỗi mơi trường (Photobacterium và MT K 2%) 1ml mẫu dịch nuôi vi khuẩn được đo tại các thời điểm cách nhau 4 giờ trong một ngày (4 h, 8 h ngày thứ nhất, 23 h, 27 h, 31h ngày thứ hai và 47 h, 51h ngày thứ ba).
d. Phương pháp xác định cường độ phát quang
Cường độ phát quang được xác định bởi lượng ánh sáng thu được từ dịch nuôi lỏng Vibrio fischeri thông qua giá trị ánh sáng tương đối RLU.
Phương pháp được tiến hành theo Modern Water với 2 môi trường lỏng Photobacterium và MT K 2%. Khi đó dịch ni lỏng vi khuẩn được xác định giá
trị ánh sáng tương đối RLU với thể tích mẫu được đo là 1ml vào các thời điểm nuôi lỏng cách nhau 4 giờ trong ngày (4h, 8h ngày thứ nhất, 23 h, 27 h, 31 h ngày thứ hai và 47 h, 51 h ngày thứ ba).
Máy Deltatox II được sử dụng để xác định cường độ phát quang của Vibrio
fischeri. Theo bộ hướng dẫn của máy, cường độ phát quang được định lượng
thông qua trị số ánh sáng (photon light) thu nhận được từ mẫu vi khuẩn lỏng với đơn vị đo là RLU (Relative Light Units - đơn vị ánh sáng tương đối). Đối với các thử nghiệm xác định độc tính của kim loại đến khả năng phát quang của vi khuẩn thì cường độ phát quang được biểu thị gián tiếp qua % ánh sáng mất đi hoặc thêm vào (tính theo cơng thức 2a, 2b, 2c, 2d).
% cường độ phát quang = 100% - % ánh sáng mất đi (Ct > St) (2a) % cường độ phát quang = 100% + % ánh sáng thêm vào (Ct < St) (2b) % ánh sáng mất đi = [(Ct - St)/Ct]*100% (Ct > St) (2c)
% ánh sáng thêm vào = [(Ct - St)/Ct]*100% (Ct < St) (2d)
Trong đó, Ct: trị số ánh sáng của mẫu đối chứng tại thời điểm t (5, 15, 30 và 45phút)
St: trị số ánh sáng của mẫu kiểm tra tại thời điểm t (5, 15, 30 và 45phút) e. Phương pháp xác định mật độ tế bào
Mật độ tế bào được xác định bằng cách đếm khuẩn lạc (tính theo đơn vị CFU/ml) từ dịch nuôi vi khuẩn trên môi trường thạch tương ứng. Phương pháp giúp lựa chọn môi trường thạch phù hợp để nuôi cấy tạo nguồn Vibrio fischeri tạo tiền đề cho các thử nghiệm tiếp theo.
Phương pháp được tiến hành như sau:
- Khuẩn lạc vi khuẩn được hoạt hóa trong 5ml mỗi mơi trường lỏng (TCBS 2%, Photobacterium, MT K 2%) ở 26oC với tốc độ lắc 200 vòng/phút trong 23h.
- Dịch vi khuẩn (mỗi mơi trường) được pha lỗng từ 100 - 106 lần.
- 100 µl của các ống pha lỗng 100 - 106 mỗi mơi trường được cấy trải trên thạch tương ứng.
- Các đĩa thạch được ủ ở 26oC trong 23 - 48h sau đó số khuẩn lạc trên từng đĩa được đếm và lấy giá trị trung bình ở những đĩa có số lượng khuẩn lạc đếm được.
Mật độ tế bào CFU/ml được tính theo cơng thức: C0 = [(Cn-1+ Cn+ Cn+1))/3]×10 Trong đó:
- Co: mật độ tế bào
- Cn-1, Cn, Cn+1: số lượng khuẩn lạc đếm được tại 3 đĩa thạch ở nồng độ liên tiếp.
- 10: hệ số tỉ lệ (giữa 100 µl dịch vi khuẩn được cấy gạt với 1 ml dùng để tính tốn)
f. Phương pháp xác định ảnh hưởng của mật độ tế bào vi khuẩn tới cường độ phát quang
Phương pháp được tiến hành để xác định mật độ tế bào vi khuẩn. Các bước thực hiện:
- Vi khuẩn được nuôi lỏng trong 5ml Photobacterium ở 26oC trong 23h. - Dịch vi khuẩn trên được pha loãng 5, 10, 20, 40, 80 lần bằng NaCl 2% để tạo dãy mật độ vi khuẩn có giá trị lần lượt là (1) 5,6×108 CFU/ml, (2) 2,8×108 CFU/ml, (3) 1,4×108 CFU/ml, (4) 0,7×108 CFU/ml, (5) 0,35×108 CFU/ml).
- Dãy mật độ vi khuẩn trên được xác định mật độ quang ở bước sóng 600nm.
3.5.2.2. Phương pháp nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát quang của vi khuẩn Vibrio fischeri
a. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường
Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường đến cường độ phát quang của vi khuẩn V. fischeri theo các bước:
- Vi khuẩn đã hoạt hóa được ni lỏng trong 100ml Photobacterium
- Trong các bình tam giác 250ml được điều chỉnh pH thay đổi từ pH 4,0 đến pH 8,0 (4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0), lượng giống cấy 1%, các bình được ni ở 26oC, tốc độ lắc 200 vòng/phút.
- Số lượng tế bào CFU/ml và cường độ phát quang các bình ni lỏng được xác định sau 23 giờ nuôi.
- Cường độ phát quang được đo từ 10µl vi khuẩn sau 23 giờ nuôi trong 990µl dung dịch pha lỗng NaCl 2%.
b. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ muối
- Vi khuẩn đã hoạt hóa được ni lỏng trong 100ml Photobacterium.
- Trong bình tam giác 250ml nồng độ NaCl được thay đổi từ 1,0% đến 6,0% (1%; 2%; 3%; 4%; 5%, 6%) lượng giống cấy 1%, các bình được ni ở 26oC, tốc độ lắc 200 vòng/phút.
- Số lượng tế bào CFU/ml và cường độ phát quang các bình ni lỏng được xác định sau 23 giờ nuôi.
- Cường độ phát quang được đo từ 10µl vi khuẩn sau 23 giờ nuôi trong 990µl dung dịch pha lỗng NaCl 2%.
c. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường
- Vi khuẩn đã hoạt hóa được ni lỏng trong 100ml Photobacterium
- Trong bình tam giác 250ml), trong đó các bình được ni ở nhiệt độ môi trường từ 4oC đến 40oC (4oC ; 20oC ; 25oC; 30oC ; 35oC; 40oC) lượng giống cấy 1%, tốc độ lắc 200 vòng/phút.
- Số lượng tế bào CFU/ml và cường độ phát quang các bình ni lỏng được xác định sau 23 giờ nuôi.
- Cường độ phát quang được đo từ 10µl vi khuẩn sau 23 giờ ni trong 990µl dung dịch pha lỗng NaCl 2%.
3.5.2.3. Phương pháp nghiên cứu sự ức chế của một số hóa chất độc hại đến sự phát quang của Vibrio fischeri
a. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số kim loại nặng (As, Pb, Hg)
Ảnh hưởng của nồng độ kim loại đến cường độ phát quang được đánh giá bởi một dãy nồng độ khác nhau của kim loại thử nghiệm với dịch vi khuẩn Vibrio fischeri có mật độ khơng đổi. Từ đó, độc tính kim loại nặng được xác định thông qua giá trị EC50 (giá trị nồng độ gây ảnh hưởng 50% khả năng phát quang của vi khuẩn sau khi tiếp xúc với kim loại nặng và được xác định tại các thời điểm 5, 15, 30 và 45 phút (Ban kĩ thuật Tiêu chuẩn Quốc gia, 2010; Stefan, 2012; Olesya Z, 2015).
Phương pháp được tiến hành như sau:
Với kim loại As (dãy nồng độ Na2HAsO4 được tham khảo ban đầu bởi E.Fulladosa và cộng sự, 2005 và được điều chỉnh qua khảo sát):
- Bước 1: Pha dung dịch Na2HAsO4 để tạo dãy nồng độ As5+: 0 mg/l, 0,8 mg/l; 1,6 mg/l; 3,2 mg/l; 6,4 mg/l; 12,8 mg/l; 25,6 mg/l; 51,2 mg/l; 102,4 mg/l; 225,9 (kí hiệu A0 - A8).
- Bước 2: Dịch vi khuẩn được điều chỉnh cường độ phát quang về 1,2×105 RLU
- Bước 3: Dịch vi khuẩn tham gia thử nghiệm độc học được hút với thể tích 990 µl
- Bước 4: Bổ sung mẫu nước giả bị nhiễm Na2HAsO4 (A1 - A8): 10 µl mẫu giả mỗi nồng độ được bổ sung vào 990 µl dịch vi khuẩn và được đảo trộn đều.
- Kết quả độc tính được đo tại thời điểm 5, 15, 30 và 45 phút, bởi chế độ Q - Tox trên máy Deltox II.
Với kim loại Chì (dãy nồng độ Pb(NO3)2 được tham khảo bởi E.Fulladosa và cộng sự, 2005: Thử nghiệm độc tính của Vibrio fischeri với Pb(NO3)2 được tiến hành tương tự như Na2HAsO4. Trong đó, dung dịch Pb(NO3)2 được pha để Pb2+ để tạo dãy nồng độ: 0 mg/l; 0,003 mg/l; 0,006 mg/l; 0,03 mg/l; 0,06 mg/l; 0,125 mg/l; 0,25 mg/l; 0,50 mg/l; 0,75 mg/l.
Với kim loại thủy ngân, thao tác tương tự như Na2HAsO4 (dãy nồng độ Hg(NO3)2 được tham khảo bởi E.Fulladosa và cộng sự, 2005: Thử nghiệm độc tính của Vibrio fischeri với Hg(NO3)2 được tiến hành tương tự như Na2HAsO4. Trong đó, dung dịch Hg(NO3)2 được pha để Hg2+ tạo dãy nồng độ: 0 mg/l; 0,0012 mg/l; 0,0025 mg/l; 0,005 mg/l; 0,01 mg/l; 0,02 mg/l; 0,04 mg/l; 0,08 mg/l; 1,16 mg/l.
b. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất bảo vệ thực vật (DDT, Lindane, 2,4D) Tương tự các thao tác trong nghiên cứu ảnh hưởng của kim loại nặng, các chất bảo vệ thực vật được pha trong axeton sau đó hịa lỗng vào nước cất để tạo các dải nồng độ hóa chất bảo vệ thực vật như sau:
Với DDT
Dung dịch DDT được pha thành dãy nồng độ: 0 mg/l; 40 mg/l; 45 mg/l; 50 mg/l; 55 mg/l; 60 mg/l; 65 mg/l; 70 mg/l.
Với Lindane
Dung dịch Lindane được pha thành dãy nồng độ: 0 mg/l; 35 mg/l; 40 mg/l; 45 mg/l; 50 mg/l; 55 mg/l.
Với 2,4D
Dung dịch 2,4 D được pha thành dãy nồng độ: 0 mg/l; 15 mg/l; 20 mg/l; 25 mg/l; 30 mg/l; 35 mg/l; 40 mg/l; 45 mg/l.
c. Nghiên cứu nâng cao khả năng ức chế phát quang của một số chất độc
Phương pháp bọc vi cầu alginate (Dedi, 2014)
Phương pháp bọc Vibrio fischeri bằng màng alginate được thực hiện theo các bước:
- Pha 1,5 ml dung dịch alginate (2% w/v) trộn với chất lỏng parafin (4,5 ml), và 2-3 giọt Tween 80 đặt trên máy khuấy từ ở 900 vòng/ phút trong 20 phút tạo thành hỗn hợp nhũ tương.
- Bổ sung 1,5 ml dịch vi khuẩn Vibrio fischeri vào hỗn hợp nhũ tương, trộn đều trên máy khuấy tốc độ 250 vòng/ phút trong 10 phút.
- Hỗn hợp nhũ tương và vi khuẩn được bổ sung CaCl2 0,15M- parafin (tỷ lệ 2:1 v/v), khuấy nhẹ hỗn hợp ở 80 vòng/ phút.
- Vibrio fischeri sau khi được bọc bằng các vi cầu alginate được thu lại
bằng ly tâm 1000 vòng/phút trong 10 phút, sau đó được rửa lại 3 lần bằng nước vô trùng.
- Vi cầu alginate thu được sau lọc được lưu giữ ở 5ºC trong dung dịch CaCl2 3%.
Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ tế bào trong vi cầu alginate
- Vibrio fischeri được chuẩn bị ở khoảng nồng độ tế bào (OD600) từ 0,2-1,34. - Các giá trị nồng độ tế bào được bọc alginate theo các bước tại mục a. - Sau khi tạo thành vi cầu alginate, mỗi trường hợp được lấy mẫu đo cường độ phát quang tại cùng thời điểm.
3.5.2.4. Phương pháp nghiên cứu xác định quy trình sản xuất KIT phát hiện nhanh độc tính cấp của nguồn nước
a. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện bảo quản vi khuẩn (tham khảo của Zhao, 2005; Thuan -Hieu, 2007; Carvalho, 2004; Hoefman, 2012; Peiren, 2015)
- Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện bảo quản trong bảo quản lỏng (nhiệt độ, thời gian và chất bảo quản)
+ Sử dụng vi khuẩn tươi đã được hoạt hóa và ni trong mơi trường Photobacterium, dịch vi khuẩn được ly tâm 2000 v/p, trong 20-25 phút, thu lấy tế bào.
+ Bổ sung các chất bảo quản khác nhau, với các nồng độ khác nhau vào các ống riêng biệt có hàm lượng tế bào vi khuẩn tương đồng để lựa chọn chất bảo quản và nồng độ bảo quản phù hợp nhất. Cụ thể như sau:
Bảng 3.2. Các thành phần mơi trường bảo quản lỏng
TT Kí hiệu Thành phần chất bảo quản
1 M4 Môi trường Photobacterium chứa muối NaCl 4%
2 M5 Môi trường Photobacterium chứa muối NaCl 5%
3 M6 Môi trường Photobacterium chứa muối NaCl 6%
4 M7 Môi trường Photobacterium chứa muối NaCl 7%
5 M8 Môi trường Photobacterium chứa muối NaCl 8%
6 MS4 - Môi trường Photobacterium chứa muối NaCl 4% - Sữa gầy 10%
7 MS5 - Môi trường Photobacterium chứa muối NaCl 5% - Sữa gầy 10%
8 MS6 - Môi trường Photobacterium chứa muối NaCl 6% - Sữa gầy 10%
9 MS7 - Môi trường Photobacterium chứa muối NaCl 7% - Sữa gầy 10%
10 MS8 - Môi trường Photobacterium chứa muối NaCl 8% - Sữa gầy 10%
11 MG2 - Môi trường Photobacterium
- Glyxerol 10%
12 MG4 - Môi trường Photobacterium chứa muối NaCl 4% - Glyxerol 10%
13 MG5 - Môi trường Photobacterium chứa muối NaCl 5% - Glyxerol 10%
14 MG6 - Môi trường Photobacterium chứa muối NaCl 6% - Glyxerol 10%
TT Kí hiệu Thành phần chất bảo quản 15 MG7 - Môi trường Photobacterium chứa muối NaCl 7%
- Glyxerol 10%
16 MG8 - Môi trường Photobacterium chứa muối NaCl 8% - Glyxerol 10%
17 S - Môi trường Photobacterium
- Sữa gầy 10%
18 L - Môi trường Photobacterium
- Đường Lactozo 15%
19 SA - Môi trường Photobacterium
- Đường Sacarozo 12%
20 T1 - Môi trường Photobacterium
- Trehalose 0,1M
21 T2 - Môi trường Photobacterium
- Trehalose 0,2M
22 T3 - Môi trường Photobacterium
- Trehalose 0,3M
23 T4 - Môi trường Photobacterium
- Trehalose 0,4M
24 T5 - Môi trường Photobacterium
- Trehalose 0,5M
+ Các phương án bảo quản sau đó được thực hiện các bước tương tự mục 3.5.2.3.c để bọc vi cầu alginate.
+ Mỗi phương án được bảo quản ở 4 nhiệt độ: -20ºC, -5ºC, 5ºC, 25ºC. + Các ống được lấy mẫu tần suất 1 tháng/lần đo cường độ phát quang bằng Deltox II để đánh giá mức độ, nhiệt độ, chất bảo quản và thời gian bảo quản phù hợp.
- Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện đông khô
+ Sử dụng vi khuẩn tươi đã được hoạt hóa và ni trong mơi trường Photobacterium, dịch vi khuẩn được ly tâm 2000 v/p, trong 20-25 phút, thu lấy tế bào.
+ Hòa lại dịch vi khuẩn trong một số thành phần môi trường sử dụng để đơng khơ. Qúa trình này để đạt được mật độ vi khuẩn 5.109 CFU/g mơi trường
sau khi hịa lại cần đặc hơn dịch vi khuẩn trước khi ly tâm khoảng 10 lần. Các thành phần môi trường thử nghiệm để đông khô bao gồm:
Bảng 3.3. Các thành phần môi trường đơng khơ
TT Kí hiệu Thành phần môi trường