Phần 4 Kết quả và thảo luận
4.2. Nghiên cứu sự ức chế của một số hóa chất độc hại đến sự phát quang của
4.2.3. Nghiên cứu nâng cao khả năng ức chế phát quang của một số chất độc
4.2.3.1. Đánh giá độ nhạy của vi khuẩn bọc vi cầu alginate
Các kiểm tra sinh học một số chất độc hại sử dụng vi khuẩn tươi như đã thử nghiệm trong mục 4.2.3 hoặc sử dụng thuốc thử hãng Microtox® chứa vi khuẩn Vibrio fischeri đơng khô để đánh giá độc tính nguồn nước được đo bằng máy quang phổ xách tay (Deltox II) hoặc trong phịng thí nghiệm đã được nghiên cứu (Cho, 2004; Fulladosa, 2005; Macken, 2009). Kết quả cho thấy các thử nghiệm mang lại hiệu quả để phát hiện chất độc, và cịn có thể phân biệt các chất có khả năng gây nguy hiểm hay không độc hại. Tuy nhiên nhược điểm của các phương pháp là độ nhạy thấp. Ngồi ra, phản ứng phát quang khơng ổn định do sử dụng các tế bào tự do, không được bảo vệ nên dễ bị tác động và đưa ra phản ứng phát
quang thất thường (Dedi, 2014). Một số nghiên cứu xét nghiệm độc tính bằng vi khuẩn khác đựa trên các tế bào vi khuẩn huỳnh quang hoặc phát quang tự do sử dụng protein E. coli. Tuy nhiên các các xét nghiệm này cũng không thể xác định được chất độc ở mức thấp (Lajoie, 2002; Chakraborty, 2008).
Để cải thiện hiệu suất sinh học kiểm tra độc tính (tăng độ nhạy cho vi khuẩn), nghiên cứu này đã áp dụng phương pháp được mô tả bởi Dedi và tập thể kiểm tra độc tính dựa trên Vibrio fischeri được cố định trong trong các hạt nhỏ alginate. Kết quả cho thấy, vi khuẩn sau khi được bọc vi cầu alginate đo được mức độ ổn định hơn của ánh sáng phát ra, đặc biệt độ nhạy phát hiện của phép đo đối với chất độc tăng lên đáng kể (4 - 2.470 lần), phép thử đối với một số kim loại nặng và hóa chất bảo vệ thực vật cho kết quả như bảng 4.2.
Bảng 4.2. Hiệu suất quang học xét nghiệm độc tính đối với As(V), Pb(II), Hg(II), DDT, Lindane, 2,4D (thời gian tiếp xúc 30 phút)
STT Tên chất độc (Ion) Giới hạn phát hiện (mg/L) EC50 (mg/L) QCVN 01:2009/BYT mg/L 1 As(V) 0,03-1,2 0,08 0,01 2 Hg(II) 0,001-0,08 0,004 0,001 3 Pb(II) 0,001-0,5 0,005 0,01 µg/L µg/L µg/L 4 DDT 2-65 23 2 5 Lindane 1-30 17 2 6 2,4 D 25-85 33 30
Bảng 4.2 cho thấy vi khuẩn khi được bọc vi cầu alginate nâng độ nhạy của vi khuẩn đối với chất độc lên nhiều lần (khoảng từ 4-2.470 lần) và các xét nghiệm độc tính thử nghiệm gần về hoặc thấp hơn QCCP. Phù hợp với kết quả của Dedi khi nghiên cứu bọc vi cầu alginat để ổn định, tăng độ nhạy phát hiện và giảm thời gian tiếp xúc (Dedi, 2014). Do lớp bảo vệ alginate đã làm cho các tế bào vi khuẩn ít bị tổn thương hơn với điều kiện khắc nghiệt (Dedi, 2014). Vi cầu alginate có vai trị nhóm các tế bào Vibrio fischeri lại thành từng cụm, bảo vệ và giữ các tế bào ổn định hơn về thể chất và với tác động của điều kiện môi trường,
4.2.3.2. Đánh giá ảnh hưởng của mật độ tế bào Vibrio fischeri
Nghiên cứu nhằm tối ưu lượng vi khuẩn được nạp vào trong vi cầu alginate để đạt được cường độ phát quang tối ưu. Trong một giới hạn về thể tích, cường độ ánh sáng chỉ tăng khi tăng nồng độ tế bào đến một mật độ tới hạn nào đó. Nghiên cứu mức ảnh hưởng này cho kết quả:
Hình 4.5. Sự ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn đến cường độ phát quang trong vi cầu alginate
Kết quả từ hình 4.13 cho thây: cường độ phát quang tăng tuyến tính với nồng độ tế bào trong khoảng mật độ OD600 từ 0,2-0,9, đạt cường độ phát quang cực đại ở OD600=0,9, từ giá trị này nếu tiếp tục tăng nồng độ tế bào thì cường độ phát quang đo được có chiều hướng giảm dần. Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của Dedi F., ông cũng nghiên cứu và cho thấy sự phát quang của Vibrio fischeri trong các hạt alginate tăng dần với nồng độ tế bào từ 0,15-0,78 do tỷ lệ cao các phản ứng hóa học tạo enzyme, đạt cường độ phát quang cực đại tại OD600=0,78 (Dedi,2014). Với sự gia tăng thêm nồng độ tế bào Vibrio fischeri từ 0,94 đến 1,22, cường độ phát quang giảm vì sự khuếch tán hạn chế oxy vào quần thể tế bào alginate có mật độ cao, Ảnh hưởng đến hoạt động trao đổi chất của tế bào vi khuẩn cho sản xuất DNA, RNA và Enzyme bình thường (Kim, 2003; Gill, 2000). Sự phát huỳnh quang của vi sinh vật cũng có thể xảy ra trường hợp khi quá nhiều các tế bào vi khuẩn được nạp vào các hạt nhân alginate làm cho sự phát huỳnh quang bằng các tế bào Vibrio fischeri lân cận và năng lượng để phát ra ánh sáng ít hơn (Gill, 2000; Sumner, 2006). Vì vậy, Nồng độ tế bào tối ưu trong nghiên cứu này ở OD600 0,75 đến 0,9 đã được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.