Phần 2 Tổng quan tài liệu
2.3. Cơ sở khoa học của việc sản xuất KIT xác định độc tính của mơi trường nước
2.3.1. Đặc tính phát quang của Vibrio fischeri và ảnh hưởng của chất độc đến
đến độ phát quang của vi khuẩn
2.3.1.1. Đặc tính phát quang của vi khuẩn Vibrio fischeri
Vi khuẩn V. fischeri được ứng dụng rất phổ biến trong việc nghiên cứu phát hiện các chất độc ơ nhiễm mơi trường. Điển hình là thiết bị phát hiện độc tính nhanh Microtox, là một hệ kiểm tra trong môi trường in-vitro sử dụng vi khuẩn huỳnh quang để phát hiện độc tính trong nước và nó được sử dụng như một hệ thống phân loại để phát hiện độc tính tương đối của một mẫu nước. Ứng dụng bao gồm kiểm tra các mẫu có chứa chất độc sinh học, nước thải công nghiệp,
nước xử lý trong công nghiệp, đầu ra nước sinh hoạt, các mẫu chất độc sinh thái, nước uống, chất thải nguy hại, đất, bùn lắng, nước mưa, và các sản phẩm y tế trong phản ứng sinh học.
Vibrio fischeri là một loại vi khuẩn gram âm, dị dưỡng được tìm thấy ở
vùng biển ơn đới và cận nhiệt đới. Nó có dạng hình que, có hai roi hỗ trợ cho việc di chuyển và đặc điểm nổi bật nhất là loại vi khuẩn này có khả năng phát ra ánh sáng còn gọi là phát quang sinh học. Đặc điểm này đã được sử dụng để nghiên cứu, phát hiện độc tính của mơi trường nước và giúp bảo vệ các sinh vật cộng sinh nhất định.
Vi khuẩn phát quang V. fischeri được tìm thấy trong các mối quan hệ sống tự do, cộng sinh, hoại sinh hoặc ký sinh. Các vi khuẩn biển V. fischeri tồn tại một cách tự nhiên dưới dạng một tập đoàn sinh vật phù du sống tự do hoặc là một sinh vật cộng sinh với một loài cá hoặc mực phát quang nhất định (Ruby 1976, 1999). Trong đó, các vi khuẩn này tập hợp thành từng nhóm, đóng vai trị như một cơ quan phát sáng chuyên biệt giúp cho lồi cá hoặc mực đó có khả năng phát ra ánh sáng. Ánh sáng phát ra từ các loài cá hoặc mực được cho là liên quan đến sự thu hút con mồi hoặc thậm chí là để ngụy trang.
Hình 2.4. Cấu trúc vi khuẩn Vibrio fischeri
V. fischeri thường được tìm thấy khi sống cộng sinh với loài mực Euprymna scolopes, là một lồi mực nước nơng nhỏ xuất nhiều trên bờ biển của Hawaii.
Trong suốt quá trình kiếm ăn về ban đêm của loài mực Euprymna scolopes, chúng phát ra ánh sáng chiếu thẳng xuống đáy biển và cường độ ánh sáng phát ra được điều chỉnh cho phù hợp với cường độ ánh trăng, do đó loại bỏ bóng của chính nó trên đáy biển, giúp bảo vệ nó tránh được sự tấn cơng những kẻ săn mồi. Ngược lại, loài mực này cung cấp các vi khuẩn V. fischeri chỗ ở và một nguồn chất dinh dưỡng ổn định (Visick, 2000).
Hình 2.5. Lồi mực Euprymna scolopes sống cộng sinh với Vibrio fischeri
Hiện tượng phát quang sinh học của vi khuẩn V. fischeri đã được nghiên cứu là do sự tham gia của 5 gen luxCDABE và được điều hòa bởi gen luxR và gen Luxi. Ánh sáng được phát ra từ q trình oxy hóa các hợp chất hữu cơ. Sự khác biệt về cường độ ánh sáng phát ra liên quan chặt chẽ đến quá trình chuyển hóa bên trong cơ thể sinh vật. V. fischeri là một trong những loài rất nhạy cảm với nhiều loại chất độc (Stevens, 1997; Eberhard, 1981). Chính sự nhạy cảm này khiến chúng là sự lựa chọn phổ biến của các nhà khoa học trong việc nghiên cứu các phương pháp phát hiện các chất độc ô nhiễm môi trường như kim loại và thuốc trừ sâu,... Việc giảm ánh sáng phát ra tỷ lệ nghịch với nồng độ các chất độc có trong mơi trường.
Trong phản ứng phát quang sinh học ở vi khuẩn V. fischeri, sự biến đổi flavin mononucleotide (FMNH2) đóng một vai trị rất quan trọng. Sự biến đổi FMN thành FMNH2 xảy ra đồng thời với sự biến đổi nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NAD(P)H), dưới sự xúc tác của enzyme flavin reductase.
ứng hóa học có sự tham gia của enzyme luciferase. Aldehyde chuỗi dài và các FMNH2 bị oxi hóa để giải phóng năng lượng tự do dưới dạng ánh sáng màu xanh lá cây ở bước sóng 490 nm (Inouye, 1994).
Cách đây nhiều thập kỷ, vi khuẩn chủ yếu được xem là những cá thể riêng biệt của sinh vật đơn bào và chúng khơng có tương tác hay liên hệ gì với nhau. Tuy nhiên, quan điểm này đã thay đổi khi mà ngày nay các nhà khoa học đã phát hiện ra rất nhiều lồi vi khuẩn nói chung và vi khuẩn V. fischeri có thể giao tiếp và phối hợp với nhau ở mức độ đa bào chứ không phải chỉ một tế bào đơn lẻ. Hiện tượng này được gọi là "quorum sensing". Khả năng phát quang của vi khuẩn V. fischeri phụ thuộc rất nhiều vào mật độ tế bào, ánh sáng được phát ra khi mỗi nhóm vi khuẩn này đạt đến một mật độ nhất định (Stevens, 1997; Hastings, 1971).
2.3.1.2. Cơ chế phát quang của vi khuẩn Vibrio fischeri
Hóa chất độc hại xuất hiện trong mơi trường khiến quá trình trao đổi chất của vi khuẩn bị rối loạn. Đây là một trong những nguyên nhân gây ra hiện tượng suy giảm phát quang ở Vibrio fischeri và được con người sử dụng vào việc phát hiện độc tính cấp trong nước. Theo Xiaoyan năm 2014 và Ting năm 2016 cùng các cộng sự đã giải thích hiện tượng phát quang dựa trên các phản ứng sinh hóa sau:
Ban đầu, Vibrio fischeri biến đổi FMN thành FMNH2 (flavin mononucleotide) nhờ enzyme Flavin reductase (theo phản ứng 1a).
NAD(P)H + H + FMN NAD(P) + FMNH2 (1a)
Tiếp đến, dưới tác dụng của enzyme luciferase các aldehyde chuỗi dài và phân tử FMNH2 bị oxi hóa tạo ánh sáng có bước sóng 490 nm (theo phản ứng 1b) (Tarasova, 2012).
FMNH2 + O2 + R – CHO FMN + H2O + R – COOH + hv (490 nm) (1b)
Hiện tượng phát quang sinh học ở Vibrio fischeri dưới sự điều hòa bởi gen luxR và gen LuxI lên vùng gen cấu trúc luxCDABEG (được minh họa như trong Hình 1.5). Theo Golnaz A. T., et al. 2011 cho rằng: gen luxA và luxB mã hóa hai tiểu phần α và β trong cấu trúc luciferase; luxC, luxD, luxE mã hóa các enzyme tham gia vào sự hình thành của các aldehyde chuỗi dài và gen luxG giúp nâng cao năng lực tổng hợp FMN của tế bào.
Flavin reductase
Hình 2.6. Vùng gen qui định khả năng phát quang của Vibrio fischeri (Golnaz, 2011)
Cơ chế phát quang sinh học
Trong điều kiện sống bình thường, hợp chất AHL (một chất cảm biến tự động trong phản ứng phát quang được hình thành trực tiếp từ LuxI (autoinducer) - sản phẩm của nhóm gen cấu trúc luxICDABEG) sẽ kết hợp với protein LuxR tạo phức AHL - LuxR. Phức này tác động ngược trở lại chất tự cảm biến LuxI kích thích vùng gen khởi động (trong operon luxICDABEG) thúc đẩy phiên mã làm tăng biểu hiện của vùng gen luxICDABEG, từ đó kích thích khả năng phát quang sinh học (Ting, 2016). Cơ chế điều hòa phát quang của vi khuẩn được minh họa như trong Hình 2.6
Hình 2.7. Cơ chế điều hịa phát quang sinh học của Vibrio fischeri (Ting, 2016)
Cơ chế tác động đến khả năng phát quang sinh học
Cơ chế tác động đến khả năng phát quang sinh học bao gồm cơ chế gây suy giảm và cơ chế kích thích. Nghiên cứu khẳng định độc tính của hai độc chất (kí hiệu hai độc chất là Đ) bị chi phối bởi ba yếu tố sau: khả năng cung cấp H+, khả năng bị ơxi hóa và khả năng cạnh tranh liên kết với enzyme luciferase (dựa vào năng lượng liên kết - ái lực tuy nhiên chưa định lượng được chúng đối với từng độc chất) (Ting, 2016).
Nhóm tác giả đã đưa ra ba mơ hình mơ tả hai cơ chế tác động đến khả năng phát quang của vi khuẩn. Trong đó, mơ hình (A) và (C) biểu thị cho cơ chế gây suy giảm, mơ hình (B) biểu thị cho cơ chế kích thích (minh họa trong Hình 2.7).
Tại mơ hình (A) nhận thấy, khả năng cung cấp H+ của (Đ) thấp hơn NADH, không thể cung cấp H+ cho FMN nên (Đ) sẽ bị ơxi hóa. Từ đó, chúng sẽ cạnh tranh O2 tham gia vào phản ứng tạo ánh sáng gây suy giảm khả năng phát quang. Tại mơ hình (B) nhận thấy, (Đ) có khả năng cung cấp H+ cho FMN và không bị ôxi hóa (như tại (A)), vì vậy, kích thích khả năng phát quang (mơ hình này có thể xuất hiện khi độc chất ở nồng độ thấp). Tại mơ hình (C), độc chất sẽ tác động gây bất hoạt enzyme luciferase, vì thế cũng gây suy giảm khả năng phát quang.
Hình 2.8. Cơ chế tác động đến khả năng phát quang của Vibrio fischeri gây ra bởi hai độc chất (Ting, 2016)
Như vậy, ở Vibrio fischeri có 2 cơ chế gây suy giảm phát quang liên quan đến khả năng cạnh tranh và gây bất hoạt enzyme của độc chất. Đồng thời, cơ chế
kích thích phát quang (khi độc chất ở nồng độ thấp) liên quan đến khả năng cung cấp H+ bị dư thừa và không bị ôxi hóa.