Phần 2 Tổng quan tài liệu
2.3. Cơ sở khoa học của việc sản xuất KIT xác định độc tính của mơi trường nước
2.3.2. Chế tạo KIT phát hiện nhanh độc tính cấp nguồn nước
2.3.2.1. Phương pháp bảo quản vi khuẩn lâu dài
Để bảo quản, lưu trữ vi khuẩn trong thời gian lâu dài thường áp dụng hai kỹ thuật chủ yếu bao gồm bảo quản ở nhiệt độ đông lạnh (<-150ºC) và kỹ thuật sấy khô từ đông lạnh. Phương pháp sấy khô hoặc đông khô thường được ưa chuộng hơn là bảo quản lạnh. Mặc dù bảo quản các chủng vi khuẩn ở nhiệt độ đông lạnh (<-150 ° C) thường làm tăng cao hơn tỷ lệ sống sót so với sấy khô (Heylen, 2012; Hoefman, 2012). Sấy khơ hồn tồn chủng vi khuẩn có thể được lưu trữ trong 30 năm và thậm chí vượt q mà khơng bất kỳ chi phí làm mát cao trong q trình lưu kho hoặc vận chuyển. Hơn nữa, các tế bào vi khuẩn đơng khơ có thể ngay lập tức được sử dụng sau khi mất nước mà khơng có bất kỳ bước rửa, trái với bảo quản lạnh. Tuy nhiên, đơng khơ phức tạp ở q trình vật lý bị ảnh hưởng bởi nhiều tham số và biến, chẳng hạn như môi trường tăng trưởng, nồng độ tế bào, tỷ lệ đóng băng, thuốc chống co giật, dung môi pha và thời gian (Carvalho, 2003; Carvalho, 2004; Hoefman, 2012; Morgan, 2006). Vì vậy, vi khuẩn thường nhạy cảm hơn với Sấy khô bằng đông lạnh so với bảo quản lạnh, các suy giảm chủ yếu liên quan đến đông lạnh và làm tan băng thương tích (Prakash, 2013).
Theo cơ sở trên, năm 2015 Jindrich Peiren và cộng sự đã nghiên cứu phát triển điều kiện sấy khô tối ưu cho năm chủng vi khuẩn, khả năng tồn tại của chúng sau khi đơng khơ cũng như trong q trình bảo quản, trong đó có vibrio fischeri. Quy trình đơng khơ được nhóm tác giả đưa ra có thể phân biệt được ba giai đoạn chính: Giai đoạn đơng lạnh, giai đoạn sơ chế, và sấy thứ cấp. Trong giai đoạn đóng băng, nước được chuyển thành đá, bị giữ trong chất bảo vệ tế bào. Đông lạnh trong 2 giờ ở - 80°C trong tủ lạnh và chuyển sang máy làm khơ. Trong q trình sấy sơ bộ, đá được loại bỏ qua thăng hoa bằng cách giảm áp suất và thêm nhiệt vào Sản phẩm, thu được sản phẩm khơ, do đó tạo ra một cấu trúc xốp. Trong quá trình sấy thứ cấp, chất bảo vệ tế bào loại bỏ bởi sự giải nhiệt đẳng nhiệt. Sau khi hoàn thành việc sấy thứ cấp, các hỗn hợp đã bị co lại và được đặt trên máy đông khô dưới chân khơng. Sau khi ít nhất là 18 phút, khí ga đã được kiểm tra với một kiểm tra tia lửa điện cao tần (Vander Heyden, Bỉ). Bảo quản dưới chân không đã được thực hiện để hạn chế bất kỳ sự thoái hóa và khuếch tán oxy hóa. Hồn thiện nghiên cứu này, năm 2016 Jindrich Peiren và
cộng sự tiếp tục làm sáng tỏ vai trò của việc đông khô xử lý các thông số ảnh hưởng đến sự đồng nhất của sản phẩm của vi khuẩn đông khô.
Khác với Peiren, Henry C.W. Hays và cộng sự đã mô tả một phương pháp bảo quản vi khuẩn trên môi trường khan dựa trên than hoạt tính, được tạo thành từ sấy chất lỏng (Malik, 1990b), môi trường bảo quản được làm khô trực tiếp từ pha lỏng mà khơng phải từ q trình đóng băng. Than trong các chế phẩm đơng lạnh khơ để loại bỏ Các gốc tự do oxy và khả năng làm giảm thiệt hại gây ra bởi quang oxy hóa. Lý thuyết này đã hỗ trợ từ những phát hiện của Heckly and Dimmick (1968) khi kết luận rằng nồng độ cao của các gốc tự do trong q trình đơng khơ là gây bất lợi cho khả năng tồn tại của vi khuẩn được bảo quản.
Ngoài ra, từ nhiều năm trước đây (1989) Ivan Janda và Miroslava Opekarova đã đưa ra các lưu ý kỹ thuật khi bảo quản lâu dài vi khuẩn, chính là kỹ thuật bảo quản đông khô để thử Microtox. Ở đây, vi khuẩn phát quang được bảo vệ lạnh với cường độ ion thấp (NaCl 1%) chứa 15% Lactose và 2% tinh bột. Ion thấp cùng với bảo vệ lạnh, đảm bảo tối thiểu thiệt hại cho các tế bào trong q trình sấy khơ. Nồng độ NaCl cuối cùng sau khi bù nước gần 3%, đó là tối ưu cho bài kiểm tra Microtox. Dưới những điều kiện này, tất cả năm chủng được sử dụng trong nghiên cứu này sống sót qua q trình đơng khơ với hàm lượng phát quang cịn sót lại cao.
2.3.2.2. Kỹ thuật đơng khơ
Đông khơ cịn gọi là sấy thăng hoa là một trong những phương pháp dùng để loại bỏ dung môi, và việc loại bỏ dung môi là bước cuối cùng của quy trình tách. Sự thăng hoa xảy ra khi một chất lỏng đông lạnh ở thể rắn chuyển trực tiếp sang thể hơi mà bỏ qua pha lỏng. Ngược lại, trong quá trình sấy truyền thống ở nhiệt độ phòng từ pha lỏng thường làm thay đổi chất lượng của sản phẩm sấy, và phương pháp này chỉ có thể áp dụng được với một số vật liệu sấy dễ dàng. Tuy nhiên, trong sấy thăng hoa, vật liệu sấy khơng đi qua giai đoạn thể lỏng, và do đó sản phẩm sau sấy ổn định, dễ sử dụng và có tính mỹ quan cao. Thiết bị dùng để thực hiện phương pháp này là máy đông khô.
Ba phương pháp sấy thăng hoa/đông khô thường được ứng dụng, bao gồm: (1) sấy bằng giá chia (Manifold), (2) sấy theo mẻ (Batch), và (3) sấy toàn bộ (Bulk). Mỗi phương pháp có một mục đích cụ thể khác nhau, và tùy thuộc vào sản phẩm sấy và cấu trúc mong muốn của sản phẩm cuối cùng thu được.
Quá trình sấy thăng hoa bao gồm ba giai đoạn: giai đoạn làm lạnh; giai đoạn sấy sơ cấp và giai đoạn sấy thứ cấp.
Giai đoạn 1 – Giai đoạn Tiền đông (prefreezing): Trong giai đoạn này,vật liệu sấy được chuyển từ trạng thái lỏng sang trạng thái khí, vật liệu đơng khơ trước tiên phải được làm lạnh đến nhiệt độ thích hợp. Phương pháp đơng lạnh và nhiệt độ cuối của sản phẩm lạnh đơng có thể ảnh hưởng đến khả năng đông khô thành công của vật liệu sấy.
Giai đoạn 2 – Giai đoạn sấy chủ yếu (giai đoạn sấy thăng hoa): Một số yếu tố có thể gây ảnh hưởng tới khả năng đơng khơ một hỗn hợp huyền phù đóng băng. Sau giai đoạn lạnh đông sản phẩm, cần thiết lập các điều kiện để tách loại băng nước khỏi sản phẩm bằng cách thăng hoa, kết quả thu được là sản phẩm khô cấu trúc được bảo tồn. Cần điều khiển chính xác 2 thơng số nhiệt độ và áp suất. Tỷ lệ thăng hoa băng nước từ sản phẩm lạnh đông dựa trên sự khác biệt về áp suất hơi của sản phẩm so với áp suất hơi của bình ngưng tụ băng nước. Các phân tử di chuyển từ mẫu có áp suất cao đến vùng có áp suất thấp hơn. Vì áp suất hơi có liên quan đến nhiệt độ, nên nhiệt độ của sản phẩm phải cao hơn nhiệt độ của bẫy lạnh (hay cịn gọi là bình ngưng tụ băng nước). Cần lưu ý: nhiệt độ mà tại đó một sản phẩm bị lạnh đông được cân bằng giữa nhiệt độ để duy trì tính tồn vẹn của sản phẩm lạnh đơng và nhiệt độ để duy trì tối đa áp suất hơi của sản phẩm. Sự cân bằng này là yếu tố then chốt để tối ưu hóa q trình sấy.
Giai đoạn 3 – Giai đoạn sấy thứ cấp (Giai đoạn bốc hơi ẩm còn lại): Sau khi kết thúc giai đoạn 2, và tất cả băng đã thăng hoa, tuy nhiên vẫn còn ẩm liên kết tồn tại bên trong vật sấy. Sản phẩm nhìn có vẻ khơ, nhưng thực tế ẩm còn lại tương đối cao khoảng 7-8%. Giai đoạn sấy thứ cấp này tại nhiệt độ cao hơn là quá trình cần thiết để bốc hơi ẩm liên kết còn lại đạt hiệu suất tối đa nhất. Quá trình này được gọi là sự giải hấp đẳng nhiệt vì ẩm liên kết sẽ được bay hơi khỏi sản phẩm.
Giai đoạn 3 này thường được duy trì tại nhiệt độ sản phẩm cao hơn nhiệt độ môi trường xung quanh nhưng phải phù hợp với độ nhạy nhiệt của sản phẩm. Tất cả các điều kiện khác, như áp suất và nhiệt độ bình ngưng vẫn giữ nguyên. Bởi vì đây là quá trình giải hấp, nên áp suất chân không càng thấp càng tốt (khơng có áp suất cao) và nhiệt độ bình ngưng lạnh đến mức có thể đạt được. Giai đoạn 3 này thường được thực hiện trong khoảng bằng từ 1/3 đến 1/2 so với thời gian thăng hoa ở giai đoạn 2.