Vibrio fischeri Từ đồ thị Hình 4.9, nhận thấy:
Các đường đồ thị cường độ phát quang của vi khuẩn tại các thời điểm 5, 15, 30, 45 phút có chiều hướng thay đổi tương đối giống nhau và đồ thị cường độ phát quang tại các thời điểm có sự giảm nhỏ tại các khoảng nồng độ 0,0012-0,01 mg/l, nhưng tạo độ dốc lớn, đột ngột trong khoảng nồng độ từ 0,01 - 0,08 mg/l. Điều này cho thấy cường độ phát quang giảm mạnh ở khoảng nồng độ này và sự tăng giảm ít hơn ở các khoảng nồng độ nghiên cứu còn lại. Sự giảm nhanh chóng mức ánh sáng của vi khuẩn trong phạm vi nồng độ Hg (II) hẹp đã được báo cáo trước đây bởi Ribo´và cộng sự (Ribo´, 1989). Kết quả này có thể là do với ái lực rất cao của Hg (II) cho nhóm -SH như những nhóm có mặt trong glutathione và cysteine, thành phần tham gia vào cơ chế bảo vệ tế bào (Gaubin, 2000) hoặc do
thực tế chúng hoạt động mạnh trên màng tế bào gây thay đổi cả chức năng và khả năng ổn định tế bào (Repetto, 1993).
Qua đồ thị xác định được các giá trị nồng độ ảnh hưởng như sau: EC10, EC50, và EC90 tương ứng là 0,01 ± 0,01mg/l; 0,045 ± 0,01mg/l; 0,12 ± 0,01mg/l, ứng với thời gian tiếp xúc là 5 phút; 0,007 ± 0,001mg/l; 0,03 ± 0,002mg/l; 0,06 ± 0,01mg/l, ứng với thời gian tiếp xúc 15 phút.
Với thời gian tiếp xúc lớn hơn, cường độ phát quang của Vibrio fischeri giảm mạnh khi tăng nồng độ của Hg2+. Các giá trị EC10, EC50 và EC90 lần lượt là 0,005 ± 0,001mg/l; 0,019 ± 0,001mg/l; 0,04 ± 0,01mg/l, ứng với thời gian tiếp xúc 30 phút, 0,0025 ± 0,001mg/l; 0,015 ± 0,01mg/l, 0,035 ± 0,002 mg/l, ứng với thời gian tiếp xúc là 45 phút.
Mối quan hệ giữa nồng độ kim loại nặng (As5+, Pb2+, Hg2+) và độ phát quang của Vibrio fischeri đã được thế hiện trên hình 4.7, 4.8, 4.9. Nhìn chung, kết quả này có sự sai khác đối với nghiên cứu trước đây và chênh lệch hạn chế nhất được so sánh với nghiên cứu của Fulladosa, 2004. So với nghiên cứu của Fulladosa, 2005, Pb2+, Hg2+ có khoảng phát hiện nhỏ hơn, sự sai khác khơng lớn, trong khi As5+ lại có khoảng phát hiện hẹp hơn nghiên cứu của ơng. Cụ thể khoảng phát hiện trong nghiên cứu này đối với As5+ là 0,8-102,4 mg/L; Pb2+ là 0,003-0,75 mg/L; Hg2+ là 0,0012-0,16 mg/L, trong nghiên cứu của Fulladosa, các giá trị này lần lượt là 0,44-3600 mg/L; 0,15-1,35 mg/L; 0,01- 0,72 mg/L. Khoảng phát hiện có sự chênh lệch so với nghiên cứu của Fulladosa, tuy nhiên mức độ xếp hạng độc tính lại đưa ra kết quả tương đồng: As5+< Pb2+< Hg2+ (mức độc tính tăng dần), thứ tự này cũng là kết quả được đưa ra của Chi-Ying, 2004.
Các sự khác biệt trong giá trị phát hiện ngồi yếu tố chính là chủng Vibrio fischeri được phân lập, có thể là do sự khác biệt về độ pH trong các xét nghiệm (giá trị pH là đôi khi không đề cập) như báo cáo trước đó (Ghosh, 1996;. Villaescusa, 1997; Fulladosa, 2005). Sự khác biệt quan trọng hơn được quan sát thấy khi sử dụng phương pháp pha loãng vi khuẩn khác nhau, đối với giao thức thử nghiệm cơ bản sử dụng trong Microtox là 2% NaCl. Đó là trường hợp của McCloskey et al., 1996 liên quan đến các bài kiểm tra thực hiện giải pháp NaNO3 3,02% và kết quả báo cáo của Ghosh et al., 1996 đã thử nghiệm trong 2,5% NaCl.
4.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số hóa chất bảo vệ thực vật
4.2.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ DDT tới cường độ phát quang của Vibrio fischeri và ngưỡng độc tính
Các loại thuốc bảo vệ thực vật sau khi hòa tan trong axeton được pha loãng bằng nước cất, sử dụng để xác định độc tính, theo dải nồng độ pha lỗng tại mục 3.5.2.3.1. Kết quả cho thấy:
Hình 4.2. Sự ảnh hưởng của DDT đến cường độ phát quang của
Vibrio fischeri
Từ đồ thị nhận thấy sự giảm không đồng đều mức phát xạ ánh sáng ở các khoảng thời gian thử nghiệm. Mức giảm ánh sáng ở 15 phút đầu nhanh hơn so với thời gian sau. Các giá trị EC10, EC50 và EC90 xác định được tại các khoảng thời gian tiếp xúc lần lượt là: ở thời gian 5 phút: 42 ± 1mg/l; 54 ± 1mg/l; >70mg/l, thời gian tiếp xúc 15 phút: 40 ± 1mg/l; 52 ± 1mg/l; >70mg/l, thời gian tiếp xúc 30 phút: <40 mg/l; 52 ± 1mg/l; >70mg/l, thời gian tiếp xúc 45 phút: <40 mg/l; 52 ± 1mg/l; 67±1mg/l.
4.2.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ Lindane (666) tới cường độ phát quang của Vibrio fischeri và ngưỡng độc tính
Hình 4.3. Sự ảnh hưởng của Lindane (666) đến cường độ phát quang của
Vibrio fischeri
Đồ thị cho thấy sự giảm không đồng đều mức phát xạ ánh sáng ở các khoảng thời gian thử nghiệm. Mức giảm ánh sáng tương đối đồng đều ở các khoảng nồng độ. Ở các khoảng thời gian có sự giảm ánh sáng nhẹ, biểu hiện ở khoảng các giữa các đường của 4 khoảng nồng độ nhỏ. Như vậy đối với lindane, ánh sáng phát ra phụ thuộc chính vào khoảng nồng độ hơn là thời gian tiếp xúc. Các giá trị EC10, EC50 và EC90 xác định được tại các khoảng thời gian tiếp xúc lần lượt là: ở thời gian 5 phút: 37 ± 1mg/l; 44 ± 1mg/l; >55mg/l, thời gian tiếp xúc 15 phút: 36 ± 1mg/l; 43 ± 1mg/l; >55mg/l, thời gian tiếp xúc 30 phút: <35 mg/l; 42 ± 1mg/l; 55 ± 1mg/l, thời gian tiếp xúc 45 phút: <35 mg/l; 41 ± 1mg/l; 54±1mg/l.
Khác với DDT, Lindane có khoảng phát hiện hẹp (35-55mg/L) và gây suy giảm ánh sáng nhanh chóng, do đó sự xác định EC10 khó có thể xác định một cách chính xác.
4.2.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ 2,4D tới cường độ phát quang của Vibrio fischeri và ngưỡng độc tính
Tương tự các chất độc được thử nghiệm, 2,4 D được thử nghiệm với một dãy pha loãng từ 15-45 mg/l. Mức độ ảnh hưởng của các nồng độ và thời gian tiếp xúc được thể hiện trên đồ thị 4.12:
Hình 4.4. Sự ảnh hưởng của 2,4 D đến cường độ phát quang của
Vibrio fischeri
Từ đồ thị nhận thấy: Khác với DDT và Lindane, cả nồng độ và thời gian tiếp xúc đều có ảnh hưởng đáng kể đến độ phát quang của vi khuẩn. Ánh sáng giảm mạnh ở khoảng nồng độ 25-30mg/l. Mức giảm ánh sáng ở 15 -30 phút có sự thay đỏi ít hơn so với các khoảng thời gian còn lại. Các giá trị EC10, EC50 và EC90 xác định được tại các khoảng thời gian tiếp xúc lần lượt là: ở thời gian 5 phút: 15 ± 1mg/l; 31 ± 1mg/l; >45mg/l, thời gian tiếp xúc 15 phút: < 15 mg/l; 28 ± 1mg/l; 44 ± 1 mg/l, thời gian tiếp xúc 30 phút: <15 mg/l; 27 ± 1mg/l; 39 ± 1 mg/l, thời gian tiếp xúc 45 phút: <15 mg/l; 25 ± 1mg/l; 34±1mg/l.
4.2.3. Nghiên cứu nâng cao khả năng ức chế phát quang của một số chất độc
4.2.3.1. Đánh giá độ nhạy của vi khuẩn bọc vi cầu alginate
Các kiểm tra sinh học một số chất độc hại sử dụng vi khuẩn tươi như đã thử nghiệm trong mục 4.2.3 hoặc sử dụng thuốc thử hãng Microtox® chứa vi khuẩn Vibrio fischeri đông khô để đánh giá độc tính nguồn nước được đo bằng máy quang phổ xách tay (Deltox II) hoặc trong phịng thí nghiệm đã được nghiên cứu (Cho, 2004; Fulladosa, 2005; Macken, 2009). Kết quả cho thấy các thử nghiệm mang lại hiệu quả để phát hiện chất độc, và cịn có thể phân biệt các chất có khả năng gây nguy hiểm hay không độc hại. Tuy nhiên nhược điểm của các phương pháp là độ nhạy thấp. Ngoài ra, phản ứng phát quang không ổn định do sử dụng các tế bào tự do, không được bảo vệ nên dễ bị tác động và đưa ra phản ứng phát
quang thất thường (Dedi, 2014). Một số nghiên cứu xét nghiệm độc tính bằng vi khuẩn khác đựa trên các tế bào vi khuẩn huỳnh quang hoặc phát quang tự do sử dụng protein E. coli. Tuy nhiên các các xét nghiệm này cũng không thể xác định được chất độc ở mức thấp (Lajoie, 2002; Chakraborty, 2008).
Để cải thiện hiệu suất sinh học kiểm tra độc tính (tăng độ nhạy cho vi khuẩn), nghiên cứu này đã áp dụng phương pháp được mô tả bởi Dedi và tập thể kiểm tra độc tính dựa trên Vibrio fischeri được cố định trong trong các hạt nhỏ alginate. Kết quả cho thấy, vi khuẩn sau khi được bọc vi cầu alginate đo được mức độ ổn định hơn của ánh sáng phát ra, đặc biệt độ nhạy phát hiện của phép đo đối với chất độc tăng lên đáng kể (4 - 2.470 lần), phép thử đối với một số kim loại nặng và hóa chất bảo vệ thực vật cho kết quả như bảng 4.2.
Bảng 4.2. Hiệu suất quang học xét nghiệm độc tính đối với As(V), Pb(II), Hg(II), DDT, Lindane, 2,4D (thời gian tiếp xúc 30 phút)
STT Tên chất độc (Ion) Giới hạn phát hiện (mg/L) EC50 (mg/L) QCVN 01:2009/BYT mg/L 1 As(V) 0,03-1,2 0,08 0,01 2 Hg(II) 0,001-0,08 0,004 0,001 3 Pb(II) 0,001-0,5 0,005 0,01 µg/L µg/L µg/L 4 DDT 2-65 23 2 5 Lindane 1-30 17 2 6 2,4 D 25-85 33 30
Bảng 4.2 cho thấy vi khuẩn khi được bọc vi cầu alginate nâng độ nhạy của vi khuẩn đối với chất độc lên nhiều lần (khoảng từ 4-2.470 lần) và các xét nghiệm độc tính thử nghiệm gần về hoặc thấp hơn QCCP. Phù hợp với kết quả của Dedi khi nghiên cứu bọc vi cầu alginat để ổn định, tăng độ nhạy phát hiện và giảm thời gian tiếp xúc (Dedi, 2014). Do lớp bảo vệ alginate đã làm cho các tế bào vi khuẩn ít bị tổn thương hơn với điều kiện khắc nghiệt (Dedi, 2014). Vi cầu alginate có vai trị nhóm các tế bào Vibrio fischeri lại thành từng cụm, bảo vệ và giữ các tế bào ổn định hơn về thể chất và với tác động của điều kiện môi trường,
4.2.3.2. Đánh giá ảnh hưởng của mật độ tế bào Vibrio fischeri
Nghiên cứu nhằm tối ưu lượng vi khuẩn được nạp vào trong vi cầu alginate để đạt được cường độ phát quang tối ưu. Trong một giới hạn về thể tích, cường độ ánh sáng chỉ tăng khi tăng nồng độ tế bào đến một mật độ tới hạn nào đó. Nghiên cứu mức ảnh hưởng này cho kết quả:
Hình 4.5. Sự ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn đến cường độ phát quang trong vi cầu alginate
Kết quả từ hình 4.13 cho thây: cường độ phát quang tăng tuyến tính với nồng độ tế bào trong khoảng mật độ OD600 từ 0,2-0,9, đạt cường độ phát quang cực đại ở OD600=0,9, từ giá trị này nếu tiếp tục tăng nồng độ tế bào thì cường độ phát quang đo được có chiều hướng giảm dần. Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của Dedi F., ông cũng nghiên cứu và cho thấy sự phát quang của Vibrio fischeri trong các hạt alginate tăng dần với nồng độ tế bào từ 0,15-0,78 do tỷ lệ cao các phản ứng hóa học tạo enzyme, đạt cường độ phát quang cực đại tại OD600=0,78 (Dedi,2014). Với sự gia tăng thêm nồng độ tế bào Vibrio fischeri từ 0,94 đến 1,22, cường độ phát quang giảm vì sự khuếch tán hạn chế oxy vào quần thể tế bào alginate có mật độ cao, Ảnh hưởng đến hoạt động trao đổi chất của tế bào vi khuẩn cho sản xuất DNA, RNA và Enzyme bình thường (Kim, 2003; Gill, 2000). Sự phát huỳnh quang của vi sinh vật cũng có thể xảy ra trường hợp khi quá nhiều các tế bào vi khuẩn được nạp vào các hạt nhân alginate làm cho sự phát huỳnh quang bằng các tế bào Vibrio fischeri lân cận và năng lượng để phát ra ánh sáng ít hơn (Gill, 2000; Sumner, 2006). Vì vậy, Nồng độ tế bào tối ưu trong nghiên cứu này ở OD600 0,75 đến 0,9 đã được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
4.3. NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH QUY TRÌNH SẢN XUẤT KIT PHÁT HIỆN NHANH ĐỘC TÍNH CẤP CỦA NGUỒN NƯỚC HIỆN NHANH ĐỘC TÍNH CẤP CỦA NGUỒN NƯỚC
4.3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện bảo quản
Nghiên cứu này thực hiện bảo quản vi khuẩn tạo thành bằng hai phương pháp: bảo quản lỏng bổ sung chất bảo quản và phương pháp đông khô. Mỗi phương pháp thực hiện các trường hợp bảo quản khác nhau (nồng độ, chất bảo quản khác nhau), nhằm lựa chọn phương pháp bảo quản tối ưu và xác định cụ thể thành phần bảo quản tối ưu.
4.3.1.1. Bảo quản Vibrio fischeri dạng lỏng
Quá trình này bảo quản vi khuẩn ở dạng lỏng, vi khuẩn được bảo quản bằng một số hóa chất sau khi đã loại bỏ môi trường nuôi cấy cơ bản theo các bước trình bày trong mục 3.5.2.3.1. Các thành phần hỗ trợ bảo quản bao gồm: gia tăng nồng độ muối NaCl; ba loại đường gồm: sacarose, lactose, trehalose; sữa gầy; glyxerol. Những hóa chất này có các tác dụng khác nhau mặt thúc đẩy khả năng thẩm thấu, chất bổ sung dinh dưỡng cần thiết, chất ổn định khả năng phát sáng,... Hóa chất bổ sung trong nghiên cứu này được chia làm hai thành phần (1) có tác dụng điều hịa tăng trưởng (các loại đường, sữa gầy), (2) có tác dụng bảo vệ tế bào (glyxerol, NaCl). Ngoài bổ sung các thành phần bảo quản, các phương án được kết hợp bọc vi cầu alginate để ổn định và tăng độ nhạy (theo nghiên cứu tại 4.2.3). Mục đích nghiên cứu này nhằm xác định thành phần chất bảo quản tối ưu và điều kiện nhiệt độ bảo quản phù hợp nhất.
Tổng hợp kết quả đo được cho tất cả các thành phần bảo quản và nhiệt độ bảo quản được trình bày trong Phụ lục 2.
Ảnh hưởng của thành phần chất bảo quản:
Đánh giá ảnh hưởng của thành phần chất bảo quản, vi khuẩn được bảo quản lỏng và bọc vi cầu alginate với 24 điều kiện khác nhau, được kí hiệu trong bảng 3.2, đường được lựa chọn bổ sung là đường disacchaarides, theo nghiên cứu G.Zhao (Zhao G., 2005) đường này có khả năng bảo vệ tế bào đáng kể, cả khi đông khô. Tất cả các phương án bảo quản được lưu giữu ở nhiệt độ lạnh (5ºC). Kết quả nghiên cứu khả năng bảo quản của các thành phần được đánh giá thông qua giá trị cường độ phát quang (RLU) của các ống sau các khoảng thời gian bảo quản. Kết quả cho thấy Trehalose, Lactose thể hiện mức độ bảo quản thấp ở tất cả các nồng độ thử nghiệm bao gồm giá trị phát quang còn lại sau các khoảng thời gian
thấp (giảm tới 100% ở tháng thứ 4) và mức giảm cường độ phát quang nhanh chóng (khoảng 3 tháng). Sacarose, glyxerol, gia tăng nồng độ muối ở một số nồng độ mang lại kết quả khả quan trong bảo quản ở thời gian lên đến 6 tháng. Cụ thể:
Hình 4.6. Sự ảnh hưởng của thành phần chất bảo quản đến độ phát quang của vi khuẩn (5ºC)
Từ hình 4.14 nhận thấy mơi trường bảo quản có thành phần Saccarose 12% (SA1), NaCl 5% (M5), sữa gầy 10% + NaCl 4% (MS4), sữa gầy 10% + NaCl 5% (MS5), Glyxerol 10% (MG2), có thể duy trì được cường độ ánh sáng vi khuẩn trong thời gian dài (đến 6 tháng), cường độ phát quang giảm nhanh hơn từ tháng thứ 4 (khoảng 20-30%) và cường độ phát quang đo được còn đáng kể ở tháng thứ 6 (105-106 RLU/ml). Đáng chú ý ở mẫu bảo quản bằng sữa gầy 10% có cường độ phát quang cao hơn cả so với các phương pháp mang lại hiệu quả đã được chọn lựa để so sánh. Mức cường độ ánh sáng còn lại ở tháng thứ 6 đạt cao nhất (36%) so với SA1 - 6%, M5- 12%, MS4-2%, MS5-28%, MG2-24%. Qúa trình bảo quản trong thời gian dài ln giữ được mức cường độ trong khoảng 105-106 RLU/ml đảm bảo cho q trình thử nghiệm độc tính. Sữa gầy được lựa chọn là phương pháp tối ưu cho lưu trữ vi khuẩn trong môi trường lỏng ở điều kiện lạnh (5ºC). Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của Thuan -Hieu và các đồng sự (Thuan –Hieu và cs., 2007), ông đã đưa ra kết quả điều kiện bảo quản với sữa gầy 10%, cường độ ánh sáng vi khuẩn phát ra cao nhất, cao hơn hỗn hợp sữa gầy và saccharose, hỗn hợp này lại cao hơn khi chỉ có saccharose. Nghiên cứu cho rằng
0 5x.05 1.106 1,5.106 2.106 2,5.106 3.106
sữa gầy đóng vai trị quan trọng trong bảo vệ tế bào trong điều kiện khắc nghiệt