Phần 4 Kết quả và thảo luận
4.3. Nghiên cứu xác định quy trình sản xuất KIT phát hiện nhanh độc tính cấp của
4.3.2. Nghiên cứu các thành phần phụ trợ
Các thành phần phụ trợ được bổ sung dựa vào đặc tính của vi khuẩn Vibrio fischeri, bộ thuốc thử Microtox của Hãng ModernWater (Hoa Kỳ) và Dựa theo TCVN 6831-2:2001 về chất lượng nước - Xác định ảnh hưởng ức chế của mẫu nước đến sự phát quang của vi khuẩn Vibrio fischeri (phần 2: phương pháp sử dụng vi khuẩn khô - lỏng), bao gồm:
- Dung dịch pha loãng: dùng để pha loãng mẫu thử nghiệm, là nước deion - Dung dịch hoạt hóa vi khuẩn: Dung dịch pha loãng vi khuẩn được pha bằng dung dịch NaCl 2% đảm bảo áp suất thẩm thấu, muối NaCl được pha trong nước deion.
- Dung dịch xử lý mẫu: Dựa theo kết quả phân tích thành phần bộ thuốc thử Microtox của Hãng ModernWater (Hoa Kỳ) dung dịch xử lý mẫu được chuẩn bị bằng dung dịch NaCl 22% pha từ muối NaCl trong nước deion, dùng để điều chỉnh nồng độ NaCl trong mẫu bằng cách cho 1 phần thể tích dung dịch xử lý vào 10 phần thể tích mẫu đo.
- Dung dịch chất đối chứng: Dựa theo TCVN 6831-2:200, chất đối chứng được lựa chọn là Kali dicromat (K2Cr2O7), hóa chất phổ biến trong phịng thí nghiệm và có độ ổn định cao. Yêu cầu chất đối chứng được pha có nồng độ xấp xỉ giá trị EC50 đối với ống vi khuẩn. Chất đối chứng được đo cùng trong mỗi phép thử nghiệm, là một mốc để dựa vào đó để đánh giá mức độ độc hại của mẫu thử nghiệm.
Như vậy, bộ KIT gồm 5 thành phần, một ống KIT chứa vi khuẩn và 4 thành phần phụ trợ.
Hình 4.9. Thành phần bộ KIT phát hiện độc tính cấp của nguồn nước 4.3.3. Nghiên cứu đề xuất quy trình tạo KIT phát hiện nhanh độc tính cấp nước sinh hoạt
Từ các kết quả nghiên cứu mục 4.1, 4.2 dựa trên cơ sở môi trường ni cấy, đặc tính vi khuẩn, phương pháp nâng cao độ nhạy và phương pháp bảo quản, quy trình tạo KIT phát hiện nhanh độc tính cấp nước sinh hoạt được đề xuất như sau:
Hình 4.18. Quy trình tạo KIT phát hiện nhanh độc tính cấp của nước sinh hoạt của nước sinh hoạt
HOẠT HÓA GIỐNG
NHÂN GIỐNG CẤP1
NHÂN GIỐNG CẤP 2
LÊN MEN XÁC ĐỊNH MẬT ĐỘ VI KHUẨN
THU SINH KHỐI
ỔN ĐỊNH SINH KHỐI VI KHUẨN BỘ SẢN PHẨM TẠO KIT GIỐNG DÙNG CHO SẢN XUẤT
Các hạng mục chính của quy trình bao gồm:
Giống dùng cho sản xuất: giống dùng cho sản xuất được phân lập từ nước
đầm tơm, Đình Vũ, Hải Phịng. Giống được lưu trữ tạm thời bằng kỹ thuật cấy chuyển từ môi trường thạch qua các khoảng thời gian.
Hoạt hóa giống: Giống dùng cho sản xuất được hoạt hóa trong ống nghiệm
với thế tích nhỏ. Bước này sử dụng chính mơi trường của chúng Photobacterium để tạo dinh dưỡng thúc đẩy quá trình sinh trưởng, chống mất hoạt tính.
Nhân giống cấp 1: Bước này giống hoạt hóa tiếp tục được cấy sang môi trường (Photobacterium) nhằm tăng sinh khối cho nghiên cúu trong phịng thí nghiệm.
Nhân giống cấp 2: Trong quy mô sản xuất cần nhân giống cấp 2 để nhân
một lượng giống lớn đáp ứng cho khâu giống trong sản xuất. Giống được nuôi cấy ở điều kiện tối ưu đã nghiên cứu trong tất cả các bước:
- Môi trường Photobacterium - pH = 6-7
- Nhiệt độ nuôi 20-26ºC. - Tốc độ lắc 200 vịng/phút
Lên men: Qúa trình ni cấy Vibrio fischeri từ giống để tạo sinh khối lớn
phục vụ cho bước tiếp theo.
Xác định mật độ vi khuẩn, thu sinh khối: nồng độ vi khuẩn Mục tiêu trong bộ KIT cần đạt 5.109 CFU/g, vì vậy bước này cần xác định mật độ vi khuẩn
bằng cách gạt đĩa và đếm trên mơi trường thạch. Từ đó, xác định thể tích vi khuẩn cần sử dụng để ly tâm thu sinh khối đạt mục tiêu trên.
Tạo KIT: Đây là bước quan trọng của quy trình.
- Tạo KIT: Vi khuẩn sau khi được thu sinh khối được rửa với NaCl đệm 3 lần, sau đó được bổ sung chất bảo quản và bọc vi cầu alginate, mật độ tế bào tối ưu để bọc vi cầu trong khoảng OD600 0,75-0,9. Kết quả nghiên cứu mục 4.3.1 cho phương pháp bảo quản lỏng bằng môi trường sữa gầy 10%. Bộ KIT được bảo quản ở nhiệt độ lạnh 5ºC để phù hợp cho vận chuyển sử sụng cho hoạt động dã ngoại, thực địa vùng sâu, vùng xa.
Bốn thành phần phụ trợ được chế tạo theo nghiên cứu bước 4.3.2.
Các thành phần phụ trợ khác bao gồm in ấn bao bì, nhãn mác, hịm, hộp, các ống đựng vi khuẩn được mua và đặt mua tại cơ sở tin cậy,
Bộ sản phẩm: Bộ sản phẩm KIT phát hiện nhanh độc tính cấp nước sinh
hoạt gồm 5 thành phần và máy đo Deltatox II:
Ống vi khuẩn (KIT): chứa vi khuẩn đã được xử xý, bảo quản bằng phương pháp tối ưu đã được nghiên cứu.
Các thành phần phụ trợ bao gồm: Dung dịch pha lỗng, dung dịch hoạt hóa, dung dịch đối chứng, dung dịch xử lý mẫu (đã được nghiên cứu trong mục 4.3.2).
Hình 4.19. Bộ KIT phát hiện độc tính cấp của nguồn nước 4.3.4. Nghiên cứu thử nghiệm 4.3.4. Nghiên cứu thử nghiệm
Để đánh giá độ nhạy của bộ KIT tạo thành, tiến hành sử dụng KIT để thử nghiệm đánh giá chất lượng nước đối với ba mẫu nước gồm nước lọc sau RO, mẫu nước ao và mẫu nước chứa As (V) được pha nồng độ 0,08 mg/L, ở khoảng thời gian tiếp xúc 30 phút và so sánh với thao tác tương tự đối với bộ thuốc thử Microtox của Hãng ModernWater (Hoa Kỳ). Kết quả nhận được như sau:
Bảng 4.4. Kết quả thử nghiệm đánh giá bộ KIT tự tạo và bộ KIT của hãng ModernWater (Hoa Kỳ)
STT Tên mẫu Kết quả bộ KIT
tự tạo
Kết quả bộ KIT của Hãng ModernWater
1 Mẫu nước sau lọc RO G8% G3%
2 Mẫu nước ao L18% L15%
3 Mẫu nước As(V) tự tạo L54% L47%
Ghi chú: L (loss): phần trăm ánh sáng mất đi G(Gain): Phần trăm ánh sáng tăng lên
Kết quả thử nghiệm cho thấy, bộ KIT được tạo có độ nhạy tương đương với bộ KIT đang được bán trên thị trường của hãng Modern Water (Hoa Kỳ). So với giá thành và điều kiện bảo quản, bộ KIT tự tạo chiếm ưu thế khi có thể được vận chuyển sử dụng thực tế vùng sâu, vùng xa, biên giới, hải đảo. Trong khi bộ KIT của hãng yêu cầu bảo quản ở nhiệt độ -80ºC, khó khăn cho q trình vận chuyển để sử dụng.
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1. KẾT LUẬN
Kết quả đã nghiên cứu xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu bao gồm môi trường nuôi cấy và các yếu tố ảnh hưởng đến cường độ phát quang của vi khuẩn (nhiệt độ, pH, độ muối). Môi trường nuôi cấy Vibrio fischeri phù hợp là Photobacterium ở tốc độ lắc 200 vòng/phút, nhiệt độ 26ºC, pH 6-7, NaCl 2%.
Vi khuẩn tươi Vibrio fischeri có khả năng phát hiện độc tính của kim loại nặng và hóa chất bảo vệ thực vật. Tuy nhiên nồng độ phát hiện ở mức cao so với QCVN (19-25.000 lần). Ngưỡng phát hiện của Pb 0,003-0,75 mg/l; As 0,8-102,4 mg/l; Hg 0,0012-0,16mg/l; DDT 40-70mg/l; 2,4 D 15-45 mg/l; Lindane 35-55 mg/l. Q trình bọc vi cầu alginate có thể gia tăng độ nhạy cho vi khuẩn (4-2.470 lần), mật độ vi khuẩn tối ưu cho quá trình bọc vi cầu alginate trong khoảng OD600 0,75-0,9.
Bảo quản lỏng bằng môi trường sữa gầy 10% kết hợp bọc vi cầu alginate ở nhiệt độ lưu giữu 5oC được nghiên cứu là phù hợp nhất cho quá trình tạo KIT. Quá trình bọc vi cầu alginate được kế thừa theo phương pháp thực hiện của Dedi và tập thể, 2014. Lượng ánh sáng còn lại của phương pháp này sau 6 tháng vẫn đạt 8,9.104 RLU/ml. Trên cơ sở đó, quy trình tạo KIT được đề xuất dựa trên giống đã được phân lập, sau khi nhân giống và lên men, thu sinh khối, tiến hành bổ sung sữa gầy 10% kết hợp bọc vi cầu alginate, sau đó bảo quản lạnh ở 5oC. Độ nhạy của bộ KIT tạo thành tương đương với bộ KIT đang bán trên thị trường của hãng Modern Water (Hoa Kỳ), và chiếm ưu thế hơn ở giá thành và điều kiện bảo quản.
5.2. KIẾN NGHỊ
Do hạn chế về thời gian, đề tài luận văn chưa tối ưu được hết các điều kiện bảo quản để tạo ra bộ KIT có độ nhạy phát hiện cao nhất. Đây chính là các nội dung đề nghị tiếp tục nghiên cứu và hoàn thiện trong thời gian tới.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt:
1. Ban kĩ thuật Tiêu chuẩn Quốc gia (2010). TCVN 6831: 01(02)(03) – 2010 Chất lượng nước - xác định ảnh hưởng ức chế của mẫu nước đến sự phát quang của vi khuẩn vibrio fischeri (phép thử vi khuẩn phát quang ) - Phần 1 : phương pháp sử
dụng vi khuẩn tươi, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Việt Nam.
2. Đỗ Hồng Lan Chi (2006). “Nghiên cứu sử dụng công cụ học đánh giá nguy cơ của nước thải công nghiệp đối với hệ sinh thái lưu vực sông Sài Gịn-Đồng Nai”, Tạp chí phát triển KH&CN, tập 9, số 01 - 2006.
3. Vũ Thị Minh Đức (2001). Thực tập vi sinh vật học, Nhà xuất bản đại học quốc gia Hà Nội, Hà Nội.
4. Nguyễn Thị Phương, Kĩ thuật pha chế môi trường môi trường phân lập vi khuẩn, Viện vệ sinh dịch tễ trung ương.
5. Lê Huy Bá (2008). Độc học môi trường cơ bản, NXB Đại học Quốc gia TP. HCM, 2008.
6. http://nilp.vn/Details/id/4740/O-nhiem-ton-luu-hoa-chat-bao-ve-thuc-vat-thuc- trang-va-dinh-huong-xu-ly-khac-phuc-o-nhiem-va-cai-thien-moi-truong, truy cập 8:15 ngày 17/4/2017.
Tài liệu Tiếng Anh:
7. Agilent Technologies ( 2015), Agilent 7900 ICP-MS - Specifications and Typical Performance, Agilent Technologies, Inc.
8. Andrew, S.K., D.S. James and K.B. Sandra (2005), “Fish models in behavioral toxicology”. Techniques in Aquatic Toxicology, Vol 2, CRC Press.
9. Aldenberg T., Slob W. (1993). Confidence limits for hazardous concentrations based on logistically distributed NOEC toxicity data. Ecotoxicol Environ Safety. Vol 25. pp. 48–63.
10. ATSDR (2005). Agency for Toxic Substances and Disease Registry. Division of Toxicology/Toxicology Information Branch 1600 Clifton Road NE Mailstop F-32 Atlanta, Georgia 30333.
12. Bitton G. and V.Freihoffer (1978). Influence of extracellular polysaccharides on the toxicity of copper and cadmium toward Klebsiella aerogenes. Microb. Ecol. Vol4(2). pp. 199–225.
13. Carvalho A.S., J.Silva, P.Ho, P.Teixeira, F.X.Malcata and P.Gibbs (2003) Effect of various growth media upon survival during storage of freeze-dried Enterococcus faecalis and Enterococcus durans. J Appl Microbiol. Vol 94(6). pp. 947–952.
14. Carvalho A.S., J.Silva, P.Ho, P.Teixeira, F.X.Malcata, P.Gibbs (2004) Effects of various sugars added to growth and drying media upon thermotolerance and survival throughout storage of freeze-dried Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus. Biotechnol Prog. Vol 20(1). pp.248–254. 15. Chakraborty, T., P.G.Babu, A.Alam, A.Chaudhari (2008). GFP expressing
bacterial biosensor to measure lead contamination in aquatic environmental. Curr. Sci. Vol 94. pp. 800–805.
16. Cho, J.C.; K.J.Park, H.S.Ihm, J.E.Park, S.Y.Kim, I.Kang, K.H.Lee, D.Jahng, D.H.Lee and S.J. Kim (2004). A novel continuous toxicity test system using a luminously modified freshwater bacterium. Biosens. Bioelectron. Vol 20. pp. 338–344.
17. Chi-Ying H., T.Meng-Hsiun, K.R.David and C.P.Oscar (2004). Toxicity of the 13 priority pollutant metals to Vibrio fisheri in the Microtox chronic toxicity test. The Science of the Total Environment. Vol 320. pp. 37–50
18. Coleman R.N. and A.A.Qureshi (1985). Microtox and Spirillum volutants tests for assessing toxicity of environmental samples. Bull Environ Contam Toxicol. Vol 26. pp. 150–156.
19. Cook S. V. , A. Chu, and R. H. Goodman (2000). Inflence of salinity on Vibrio ficheri and lux-modifid Pseudomonas florescens toxicity bioassays. Environmental Toxicology and Chemistry. Vol. 19(10), pp. 2474–2477.
20. Codina,J.C., A.Pe´rez-Garcı´, P.Romero and A.DeVicente (1993). A comparison of microbial bioassays for the detection of metal toxicity. Arch. Environ. Contam. Toxicol. Vol 25. pp. 250–254
21. Dedi F., L.Y.Heng, S. Surif, A.Ahmad, T.L.Ling (2014). Microencapsulated Aliivibrio fischeri in Alginate Microspheres for Monitoring Heavy Metal Toxicity in Environmental Waters. Sensors and Actuators B: Chemical. Vol 14. pp. 23248-23268.
22. Dutka, B.J., K.K.Kwan (1981). Comparison of three microbial toxicity screening test with the Microtox test. Bull. Environ. Contam. Toxicol. Vol 4. pp. 129–138 23. Eberhard A., A.L.Burlingame, C.Eberhard, G.L.Kenyon, K.H. Nealson and
N.J.Oppenheimer (1981). Structural identification of autoinducer of Photobacterium fischeri luciferase. Biochemistry. Vol 20, 2444-2449
24. Engebrecht J., K.Nealson and M.Silverman (1983). Bacterial bioluminescence: Isolation and genetic analysis of functions from Vibrio fischer. Cell. Vol 32.
pp. 773-781.
25. Engedrecht J. and M.Silverman (1984). Identification of genes and gene products necessary for bacterial bioluminescence. Proceeding of the National Academy Sciences of the United States of America. Vol 81(13). pp.4154-4158.
26. Engebrecht J. and M.Silverman. Nucleotide sequence of the regulatory locus controlling expression of bacterial genes for bioluminescence. Nucleic Acids Res, 1987. Vol 15(24). pp. 455- 467.
27. Ellgaard, E.G., J.E.Tusa and A.A.Malizia (1978). Locomotor activity of the bluegill Lepomis macrochirus: hyperactivity induced by sublethal concentrations of cadmium, chromium and zinc. Journal of Fish Biology. Vol 12(1).pp. 19-23. 28. EU (1995), “Environmental risk assessment of new and existing substances”,
Technical guidance document, draft, May.
29. Exley, C. (2000). Avoidance of Aluminum by Rainbow Trout. Environmental Toxicology and Chemistry. Vol. 19(4). pp. 933-939.
30. Fulladosa E. , J.C. Murat, M. Martı´nez, I. Villaescusa (2005); Patterns of metals and arsenic poisoning in Vibrio fischeri bacteria. Chemosphere. Vol 60. pp. 43–48.
31. Gaubin, Y., F.Vaissade, F.Croute, J.P.Soleilhavoup and
J.C.Murat (2000). Implication of free radicals and glutathione in the mechanism of metal-induced expression ofstress proteins in the A549 human lung cell-line. Biochimica et Biophysica Acta. Vol 1495. pp. 4–13.
32. Giattina, J.D. and R.R. Garton (1982). Graphical Model of Thermoregulatory Behavior by Fishes with a New Measure of Eurythermality. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. Vol 39(3). pp. 524-528.
33. Gill, G.C.; R.J.Mitchell, S.T.Chang and M.B.Gu (2000). A biosensor for the detection of gas toxicity using a recombinant bioluminescent bacterium. Biosen. Bioelectron. Vol15. pp. 23–30.
34. Golnaz A. T, S. Mirzaahmadi, M. Bandehpour, F. Laloei, A. Eidi, T. Valinasab and B. Kazemi. ( 2011 ). Molecular cloning and expression of the luciferase coding genes of Vibrio fischeri. African Journal of Biotechnology. Vol. 10(20).
pp. 4018-4023.
35. Halmi M. I. E. , H. Jirangon, W. L. W. Johari, A. R. Abdul Rachman, M. Y. Shukor and M. A. Syed (2014). Comparison of Microtox and Xenoassay Light as a Near Real Time River Monitoring Assay for Heavy Metals. The Scientific World Journal. Accepted 23 February 2014; Published 1 April 2014.
36. Hastings, JW and Greenberg, EP (1971). Quorum Sensing: the Explanation of a Curious Phenomenon Reveals a Common Characteristic of Bacteria. Journal of Bacteriology 109, 1101-1105.
37. Heckly, R.H. and R.L.Dimmick (1968). Correlations between free radical production and viability of lyophilised bacteria. Applied Microbiology. Vol 16. pp. 1081–1085.
38. Heylen K, S.Hoefman, B.Vekeman, J.Peiren and P.De Vos (2012) Safeguarding bacterial resources promotes biotechnological innovation. Appl Microbiol Biotechnol. Vol 94(3). pp. 565–574.
39. Hoefman S, H.K.Van, N.Boon, P.Vandamme, P.De Vos, K.Heylen (2012). Survival or revival: Long-term preservation induces a reversible viable but non-culturable state in methane-oxidizing bacteria. Plos One 7(4).
40. Jairo R. P., C. F. Ciemon and P. S. Morgan (2013). Lethal doses of oxbile, peptones and thiosulfate-citrate-bile-sucrose agar (TCBS) for Acanthaster planci; exploring alternative population control options. Marine Pollution Bulletin. Vol 75(1–2). pp. 133-139.
41. Janda I. and O.Miroslava. Long-term Preservation of Active Luminous Bacteria by LyophiIization (1989). Journal of bioluminescenceand chemiluminescence. Vol 3. pp. 27-29.
42. Kleerekoper, H., G.F. Westlake, J.H. Matis, and P.J. Gensler (1972). Orientation of goldfish (Carassius auratus) in response to a shallow gradient of a sublethal concentration of copper in an open field. Journal of the Fishesies Research Board of Canada. Vol 29. pp. 45-54.
43. Kim, B.C. and M.B. Gu (2003). A bioluminescent sensor for high throughput toxicity classification.Biosen. Bioelectron. Vol 18. pp. 1015–1021.
44. Lajoie, C.A.; S.C.Lin, H.Nguyen and C.J.Kelly (2002). A toxicity testing protocol using a bioluminescent reporter bacterium from activated sludge. J Microbiol. Methods. Vol 50. pp. 273–282.
45. Lei Y., W. Chen and A. Mulchandani (2006). Microbial biosensors. Analytica Chimica Acta. Vol 568(1–2). pp. 200-210.
46. Li B. (2009 ). Using Bioluminescent Bacteria to Detec Water Contaminants. Water Environment Federation. Vol 4. pp. 29 - 41.
47. Macken A.; W.Giltrap, K.Ryall, B.Foley, E.McGovern, B.McHugh and M. A Davoren (2009). Test battery approach to the ecotoxicological evaluation of cadmium and copper employing a battery of marine bioassays. Ecotoxicology. Vol 18. pp. 470–480.
48. Malik K.A. (1990). A simplified liquid drying method for the preservation of microorganisms sensitive to freezing and freezedrying. Journal of Microbiological Methods. Vol 12.pp. 125–132.
49. Maria M. D., S. J. Amalia, D.C Maria, Victor M. C. (1997). Comparative study of the toxic actions of 2,2 - Bis-p-chlorophenyl; 1,1,1-Trichloroethane and 2,2-bis-p-