Phần 4 Kết quả và thảo luận
4.3. Nghiên cứu xác định quy trình sản xuất KIT phát hiện nhanh độc tính cấp của
4.3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện bảo quản
Nghiên cứu này thực hiện bảo quản vi khuẩn tạo thành bằng hai phương pháp: bảo quản lỏng bổ sung chất bảo quản và phương pháp đông khô. Mỗi phương pháp thực hiện các trường hợp bảo quản khác nhau (nồng độ, chất bảo quản khác nhau), nhằm lựa chọn phương pháp bảo quản tối ưu và xác định cụ thể thành phần bảo quản tối ưu.
4.3.1.1. Bảo quản Vibrio fischeri dạng lỏng
Quá trình này bảo quản vi khuẩn ở dạng lỏng, vi khuẩn được bảo quản bằng một số hóa chất sau khi đã loại bỏ môi trường nuôi cấy cơ bản theo các bước trình bày trong mục 3.5.2.3.1. Các thành phần hỗ trợ bảo quản bao gồm: gia tăng nồng độ muối NaCl; ba loại đường gồm: sacarose, lactose, trehalose; sữa gầy; glyxerol. Những hóa chất này có các tác dụng khác nhau mặt thúc đẩy khả năng thẩm thấu, chất bổ sung dinh dưỡng cần thiết, chất ổn định khả năng phát sáng,... Hóa chất bổ sung trong nghiên cứu này được chia làm hai thành phần (1) có tác dụng điều hịa tăng trưởng (các loại đường, sữa gầy), (2) có tác dụng bảo vệ tế bào (glyxerol, NaCl). Ngoài bổ sung các thành phần bảo quản, các phương án được kết hợp bọc vi cầu alginate để ổn định và tăng độ nhạy (theo nghiên cứu tại 4.2.3). Mục đích nghiên cứu này nhằm xác định thành phần chất bảo quản tối ưu và điều kiện nhiệt độ bảo quản phù hợp nhất.
Tổng hợp kết quả đo được cho tất cả các thành phần bảo quản và nhiệt độ bảo quản được trình bày trong Phụ lục 2.
Ảnh hưởng của thành phần chất bảo quản:
Đánh giá ảnh hưởng của thành phần chất bảo quản, vi khuẩn được bảo quản lỏng và bọc vi cầu alginate với 24 điều kiện khác nhau, được kí hiệu trong bảng 3.2, đường được lựa chọn bổ sung là đường disacchaarides, theo nghiên cứu G.Zhao (Zhao G., 2005) đường này có khả năng bảo vệ tế bào đáng kể, cả khi đông khô. Tất cả các phương án bảo quản được lưu giữu ở nhiệt độ lạnh (5ºC). Kết quả nghiên cứu khả năng bảo quản của các thành phần được đánh giá thông qua giá trị cường độ phát quang (RLU) của các ống sau các khoảng thời gian bảo quản. Kết quả cho thấy Trehalose, Lactose thể hiện mức độ bảo quản thấp ở tất cả các nồng độ thử nghiệm bao gồm giá trị phát quang còn lại sau các khoảng thời gian
thấp (giảm tới 100% ở tháng thứ 4) và mức giảm cường độ phát quang nhanh chóng (khoảng 3 tháng). Sacarose, glyxerol, gia tăng nồng độ muối ở một số nồng độ mang lại kết quả khả quan trong bảo quản ở thời gian lên đến 6 tháng. Cụ thể:
Hình 4.6. Sự ảnh hưởng của thành phần chất bảo quản đến độ phát quang của vi khuẩn (5ºC)
Từ hình 4.14 nhận thấy mơi trường bảo quản có thành phần Saccarose 12% (SA1), NaCl 5% (M5), sữa gầy 10% + NaCl 4% (MS4), sữa gầy 10% + NaCl 5% (MS5), Glyxerol 10% (MG2), có thể duy trì được cường độ ánh sáng vi khuẩn trong thời gian dài (đến 6 tháng), cường độ phát quang giảm nhanh hơn từ tháng thứ 4 (khoảng 20-30%) và cường độ phát quang đo được còn đáng kể ở tháng thứ 6 (105-106 RLU/ml). Đáng chú ý ở mẫu bảo quản bằng sữa gầy 10% có cường độ phát quang cao hơn cả so với các phương pháp mang lại hiệu quả đã được chọn lựa để so sánh. Mức cường độ ánh sáng còn lại ở tháng thứ 6 đạt cao nhất (36%) so với SA1 - 6%, M5- 12%, MS4-2%, MS5-28%, MG2-24%. Qúa trình bảo quản trong thời gian dài luôn giữ được mức cường độ trong khoảng 105-106 RLU/ml đảm bảo cho quá trình thử nghiệm độc tính. Sữa gầy được lựa chọn là phương pháp tối ưu cho lưu trữ vi khuẩn trong môi trường lỏng ở điều kiện lạnh (5ºC). Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của Thuan -Hieu và các đồng sự (Thuan –Hieu và cs., 2007), ông đã đưa ra kết quả điều kiện bảo quản với sữa gầy 10%, cường độ ánh sáng vi khuẩn phát ra cao nhất, cao hơn hỗn hợp sữa gầy và saccharose, hỗn hợp này lại cao hơn khi chỉ có saccharose. Nghiên cứu cho rằng
0 5x.05 1.106 1,5.106 2.106 2,5.106 3.106
sữa gầy đóng vai trị quan trọng trong bảo vệ tế bào trong điều kiện khắc nghiệt và với sữa gầy, vi khuẩn phản ứng với mơi trường nhanh chóng với độ phát quang sinh học cao. Như vậy, nghiên cứu này đã đưa ra phương pháp bảo quản lỏng bằng môi trường với sữa gầy 10% kết hợp bọc trong vi cầu alginate giúp lưu giữ ánh sáng ở mức cao nhất trong các khoảng thời gian nghiên cứu.
Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản:
Bảng 4.1 cho thấy đối với mỗi phương pháp bảo quản ở nhiệt độ -20ºC đo được Vibrio fischeri có cường độ phát quang cao hơn so với bảo quản ở các nhiệt độ khác (-5ºC, 5ºC, 25ºC) trong cùng một loại hỗn hợp bảo quản, cao hơn hẳn khi bảo quản ở nhiệt độ phòng (25ºC). Ở nhiệt độ -20ºC mức giảm ánh sáng chậm và ổn định hơn sau các tháng. Nhiệt độ bảo quản đóng vai trị hỗ trợ chất bảo bảo lưu giữ sự sống của Vibrio fischeri. Vì vậy, chất bảo quản đóng vai trị chính, tức là q trình nghiên cứu các trường hợp bảo quản, loại hỗn hợp bảo quản cho kết quả khả quan trong thời gian dài ở 5ºC (hình 4.15) thì khi lưu giữ ở -20ºC, -5ºC, 25ºC cho kết quả tuyến tính tương tự. Do đó, lựa chọn đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ lưu giữ đến Vibrio fischeri trong trường hợp bảo quản bằng sữa gầy 10% (thành phần bảo quản tốt nhất trong mục nghiên cứu chất bảo quản). Kết quả cho thấy:
Hình 4.7. Sự ảnh hưởng của nhiệt độ khi bảo quản với sữa gầy 10% đến độ phát quang của vi khuẩn
0 5.105 1.106 1,5.106 2,5.106 3,5.106 2.106 3.106
Đồ thị cho thấy khả năng bảo quản giảm dần ở các mức nhiệt độ theo chiều hướng -20ºC > -5ºC > 5ºC > 25ºC, chỉ riêng bảo quản ở nhiệt độ phòng (25ºC) vi khuẩn Vibrio fischeri có cường độ phát quang đạt giá trị nhỏ hơn hẳn và giảm mạnh ở các khoảng thời gian bảo quản. Cụ thể cường độ phát quang còn lại sau 6 tháng chỉ bằng 1/1.500 lần so với bảo quản ở -20ºC, -5ºC, 5ºC trong cùng một phương án bảo quản. Ở nhiệt độ -20ºC, -5ºC, 5ºC cho khả năng bảo quản tương đối cao, trên 28% sau 6 tháng bảo quản và chênh lệch cường độ quang giữa ba nhiệt độ bảo quản khơng lớn, chỉ khoảng 2-6%. Vì vậy để thuận lợi, đảm bảo cho sử dụng khi thực địa vùng sâu, vùng xa, nhiệt độ bảo quản được lựa chọn ở 5ºC.
4.3.1.2. Bảo quản Vibrio fischeri dạng đông khô
Bảng 4.3. Ảnh hưởng của thành phần đông khô và nhiệt độ bảo quản đến cường độ phát quang của vi khuẩn Vibrio ficheri
STT Thời gian Nhiệt độ (ºC) ĐK1 ĐK2 ĐK3 1 1 tháng -20oC 1,1.106 1,0.106 8,1.106 2 -5oC 1,09.106 1,00.106 7,80.105 3 5oC 1,01.106 9,50.105 7,10.105 4 2 tháng -20oC 9,60.105 9,20.105 6,40.105 5 -5oC 8,80.105 8,80.105 6,10.105 6 5oC 7,70.105 8,10.105 5,50.105 7 3 tháng -20oC 7,20.105 5,20.105 3,20.105 8 -5oC 6,10.105 4,70.105 2,60.105 9 5oC 5,00.105 4,60.105 2,10.105 10 4 tháng -20oC 3,80.105 1,20.105 6,00.104 11 -5oC 2,30.105 9,80.104 5,80.104 12 5oC 1,70.105 8,60.104 5,20.104 13 5 tháng -20oC 9,80.104 5,10.103 1,10.104 14 -5oC 5,60.104 4,50.103 8,20.103 15 5oC 3,30.104 4,10.103 7,60.103 16 6 tháng -20oC 1,20.104 2,10.103 6,30.103 17 -5oC 8,10.103 1,70.103 1,20.103 18 5oC 5,00.103 3,80.102 5,60.102
Phương pháp đông khô được sử dụng hữu hiệu khi lưu giữu vi khuẩn trong khoảng thời gian rất dài, có thể lên đến 30 năm (Carvalho, 2004; Hoefman, 2012). Trong nghiên cứu này đã thử nghiệm 3 thành phần môi trường đông khô gồm: môi trường Photobacterium bổ sung sữa sầy 10% (ĐK1), môi trường Photobacterium thành phần NaCl 1% + sữa sầy 10% (ĐK2), môi trường Photobacterium bổ sung đường lactose 10% (ĐK3). Một số vi khuẩn đã nghiên cứu cho thấy khả năng tồn tại của tế bào khi đông lạnh nhanh (-60ºC) thấp hơn q trình đơng lạnh chậm (-20ºC) (Zhao, 2005). Do vậy, các phương án bảo quản sau khi bổ sung hỗn hợp bảo quản được đông đá ở -20ºC trước khi tiến hành đông khô. Sản phẩm đông khô để bảo vệ tế bào vi khuẩn được bảo quản lạnh ở 3 mức nhiệt độ: -20ºC, -5ºC, 5ºC. Cụ thể:
Kết quả cho thấy, bảo quản bằng sữa gầy 10% trong môi trường Photobacterium (ĐK1) mang lại hiệu quả cao hơn so với ĐK2 và ĐK3. Tương đồng khi bảo quản lỏng, môi trường sữa gầy 10% cũng cho hiệu quả cao nhất, tuy nhiên giá trị cường độ phát quang đo được khi đông khô thấp hơn rất nhiều so với bảo quản lỏng. Trong cùng điều kiện đông khơ thích hợp nhất (ĐK1), nhiệt độ bảo quản có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng phát quang của vi khuẩn, được thể hiện trên đồ thị 4.16.
Hình 4.8. Sự ảnh hưởng của nhiệt độ khi bảo quản vi khuẩn đông khô với sữa gầy 10% đến độ phát quang của vi khuẩn
0 2.105 4.105 6.105 8.105 1.106 1,2.106 1,4.106
Như vậy, quá trình thử nghiệm bảo quản vi khuẩn trong trường hợp bảo quản lỏng và đông khơ cho thấy cả hai phương pháp đều có khả năng bảo quản vi khuẩn trong thời gian tương đối dài (6 tháng). Tuy nhiên, phương pháp bảo quản lỏng lại cho hiệu quả bảo quản và sự ổn định ánh sáng cao hơn đơng khơ, mặc dù phương pháp này được dự đốn tốt hơn.
Kết luận: Nghiên cứu các thành phần chất bảo quản và nhiệt độ bảo quản
cho cả bảo quản lỏng và phương pháp đông khô cho thấy ở điều kiện nghiên cứu và giống vi sinh vật hiện có, phương pháp bảo quản tối ưu được xác định bằng bảo quản lỏng với môi trường sữa gầy 10%, nhiệt độ lưu trữ phù hợp cho vận chuyển và sử dụng ở 5ºC.