Phần 4 Kết quả và thảo luận
4.1. Nghiên cứu xác định các điều kiện nuôi cấy tạo vi khuẩn Vibrio fischeri
4.1.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến tốc độ sinh trưởng và cường
độ phát quang
Nghiên cứu lựa chọn môi trường và các điều kiện nuôi cấy tối ưu cho sự phát quang của Vibrio fischeri để tạo nguồn vi khuẩn dùng cho thử nghiệm độc tính và chế tạo KIT.
Vibrio fischeri được nuôi lỏng trên 03 môi trường: TCBS 2%, Photobacterium và MT K 2%. Môi trường TCBS 2% vi khuẩn khơng phát sáng, vì vậy, tiến hành theo dõi tốc độ sinh trưởng và cường độ phát quang của vi khuẩn trên hai môi trường Photobacterium và MT K 2%. Kết quả được thể hiện trên Hình 4.1.
Hình 4.1. Tương quan tốc độ sinh trưởng (thể hiện qua giá trị OD600) và cường độ phát quang (thể hiện qua giá trị photon light, đơn vị RLU) của
Kết quả cho thấy: - Tốc độ sinh trưởng:
Khoảng thời gian từ 4h đến 8h, các chỉ số tốc độ sinh trưởng của Vibrio fischeri khi nuôi trên môi trường Photobacterium tăng chậm và chậm hơn so với nuôi trên MT K 2%. Tuy nhiên, thời gian từ 8h đến 31h, các chỉ số này trên môi trường Photobacterium tăng nhanh hơn trên MT K 2%.Tới thời điểm 31 h, trong khi tốc độ sinh trưởng trên MT K 2% đã đạt giá trị cực đại thì chỉ số này vẫn tiếp tục tăng trên môi trường Photobacterium. Từ 31h đến 47h, chỉ số này đã có dấu hiệu giảm trên MT K 2% nhưng vẫn tiếp tục tăng trên Photobacterium đến giá trị cực đại. Tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn đạt cực đại trên MT K 2% tại thời điểm 31h với trị số 1,408 A ( Max
K MT
OD600 2%); trong khi đó thời điểm đạt giá trị cực đại trên Photobacterium là 47h với trị số 2,399 A
( Max rium Photobacte OD600 ) lớn gấp 1,704 lần Max K MT OD600 2%.
Sau thời điểm đạt giá trị cực đại, chỉ số tốc độ sinh trưởng trên cả 2 môi trường MT K 2% và Photobacterium đều được xác định là suy giảm với tốc độ khá nhanh, cụ thể: trên Photobacterium là 1,56 lần (tại thời điểm 47h so với 51h), trên MT K 2% giảm 1,29 lần (tại thời điểm 47h so với 31h).
Từ các đánh giá trên cho thấy tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn khi nuôi trên Photobacterium chiếm ưu thế hơn trên MT K 2%.
- Cường độ phát quang:
Từ 4h - 8h, với MT K 2% giá trị cường độ phát quang tăng nhanh và nhiều hơn (gấp 2 - 5 lần trên Photobacterium). Từ 8 - 23h, ở cả 2 môi trường giá trị tiếp tục tăng và đạt cực đại tại thời điểm 23h. Sau 23h, cường độ phát quang giảm, trong đó MT K 2% giảm mạnh hơn.
Vi khuẩn đạt giá trị cường độ phát quang cực đại vào thời điểm 23h ở cả 2 môi trường. Trên môi trường MT K 2% RLU đạt 4,6×107 ( Max
K MT
RLU 2%) tương ứng khi OD600 = 1,284 và trên mơi trường Photobacterium có trị số 2×108
( Max
rium Photobacte
RLU ) tương ứng khi OD600 = 1,17 lớn gấp 4,3 lần Max K MT RLU 2% ( Max rium Photobacte RLU = 4,3 Max K MT
RLU 2%) (Hình 4.1). Như vậy, cường độ phát quang còn phụ thuộc vào bản chất môi trường nuôi cấy, phù hợp với nghiên cứu của Stefanie và cộng sự, 2006. Thời gian duy trì khả năng phát quang trên
Photobacterium ở mức cao (23 - 47h) phù hợp với nghiên cứu trước đây (Stefanie, 2006) và kéo dài hơn trên MT K 2% ( 8 - 27h).
Qua khảo sát trên nhận thấy, vi khuẩn được nuôi lỏng trên Photobacterium ưu việt hơn MT K 2% về các chỉ số bao gồm: giá trị cực đại của tốc độ sinh trưởng, cường độ phát quang và thời gian duy trì cường độ phát quang. Như vậy, Photobacterium là môi trường lỏng phù hợp cho hoạt hóa chủng vi khuẩn trong nghiên cứu. Vi khuẩn nuôi lỏng trên Photobacterium đạt giá trị cường độ phát quang cực đại tại thời điểm 23h, do đó chúng tơi đã lựa chọn thời gian ni cấy 23h để lấy mẫu cho các thử nghiệm tiếp theo. Cũng trong khảo sát này, các yếu tố sau được xác định có ảnh hưởng tới giá trị OD600 và cường độ phát quang là: thời gian nuôi lỏng, bản chất mơi trường ni cấy và mật độ tế bào. Ngồi ra, trong nghiên cứu với các yếu tố ngoại sinh khác thì sự hiện diện của các chất ức chế và trạng thái sinh lý nội tại của vi khuẩn cũng gây ảnh hưởng đến phát quang sinh học (Waters, 1985; Nunes-Halldorson, 2003).
Hình 4.2. Vibrio fischeri được ni lỏng trên MT K 2% (trái), Photobacterium (phải) sau 23h
Dịch nuôi vi khuẩn của 3 môi trường (TCBS 2%, Photobacterium, MT K 2% được pha loãng từ 100 đến 106 lần). Các nồng độ vi khuẩn pha lỗng (mỗi mơi trường) được gạt 100 µl trên mơi trường thạch tương ứng. Giá trị mật độ tế
bào vi khuẩn được xác định bởi ba nồng độ pha loãng 104, 105 và 106 lần). Kết quả xác định mật độ tế bào thu được dẫn ra trong Bảng 4.1.
Bảng 4.1. Mật độ tế bào vi khuẩn Vibrio fischeri trong các môi trường nuôi cấy môi trường nuôi cấy
Mật độ tế bào
(CFU/ml)
Môi trường lựa chọn thử nghiệm
TCBS 2% Photobacterium MT K 2%
0 2,8×109 2,8×107
Kết quả Bảng 4.1 cho thấy mật độ tế bào vi khuẩn trên môi trường Photobacterium đạt cao nhất (2,8×109), gấp 100 lần trên MT K 2% (2,8×107). Kết quả này là phù hợp vì TCBS 2% được cải biến từ TCBS và môi trường này được biết đến là môi trường ức chế Vibrio ficheri (Li, 2006). Ngồi ra, vi khuẩn (sau 23h ni cấy) phát quang mạnh và được duy trì lâu hơn trên đĩa thạch Photobacterium (Hình 4.3).
Hình 4.3. Mức độ phát quang của Vibrio fischeri trong môi trường Photobacterium và MT K 2%, sau 23h
Từ các khảo sát trên nhận thấy Photobacterium là môi trường nuôi cấy phù hợp nuôi cấy để tạo nguồn vi khuẩn Vibrio fischeri. Ngồi ra, cần lưu ý về lượng ơxi phù hợp cho sinh trưởng của vi khuẩn khi tỉ lệ thể tích (dịch ni : định mức dụng cụ chứa dịch nuôi) được đảm bảo trong khoảng 0,2 - 0,4. Mật độ tế bào
Vibrio fischeri trên mơi trường đạt cao nhất 2,8×109 CFU/ml.