NGHIÊN CỨU
3.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Virus cúm A/H5N6 trong các mẫu dịch ngốy hầu họng của gà và vịt; mẫu mơi trường (mẫu phân tươi, mẫu nước thải, mẫu nước uống, mẫu chất thải trên lơng nhốt gia cầm) tại 12 chợ buơn bán gia cầm sống ở 3 tỉnh: Hải Phịng (các chợ Lương Văn Can, Quán Toan, Đầm Triều và chợ Thị trấn Tiên Lãng), Lạng Sơn (các chợ Đồng Đăng, Thất Khê, Hội Hoan và Na Dương) và Quảng Ninh (các chợ Minh Thành, Rừng, Địa Chất và Cái Răm).
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Tình hình chăn nuơi gia cầm tại các tỉnh từ 2010 – 6 tháng đầu năm 2016. Kết quả tiêm vaccine cúm gia cầm tại các tỉnh từ 2010 – 6 tháng đầu năm 2016.
Tình hình dịch cúm gia cầm tại các tỉnh từ 2010 - 6 tháng đầu năm 2016. Nghiên cứu lưu hành virus cúm A/H5N6 tại các chợ.
- Nghiên cứu tỷ lệ nhiễm virus cúm type A trong các mẫu bệnh phẩm. - Nghiên cứu tỷ lệ nhiễm virus cúm subtype H5 trong các mẫu bệnh phẩm. - Nghiên cứu tỷ lệ nhiễm virus cúm subtype N6 trong các mẫu bệnh phẩm. - Nghiên cứu lưu hành virus cúm A/H5N6 qua các vịng lấy mẫu.
- Nghiên cứu lưu hành virus cúm A/H5N6 tại các chợ lấy mẫu.
3.3. NGUYÊN LIỆU 3.3.1. Mẫu thí nghiệm 3.3.1. Mẫu thí nghiệm
Mẫu dịch ngốy hầu họng của gà, vịt và mẫu mơi trường tại 12 chợ đã được lựa chọn.
3.3.2. Dụng cụ, hĩa chất lấy mẫu, thiết bị, hĩa chất xét nghiệm
3.3.2.1. Dụng cụ lấy mẫu
Bảo hộ lao động, tăm bơng vơ trùng, ống đựng mẫu, thùng bảo quản mẫu, nhãn dán mẫu, phiếu ghi thơng tin, túi đựng mẫu, thuốc sát trùng, găng tay,...
3.3.2.2. Hĩa chất, trang thiết bị xét nghiệm.
a. Mơi trường bảo quản mẫu: Mơi trường PBS - Glycerol
b. Dụng cu, hĩa chất cho xét nghiệm mẫu bệnh phẩm
- Máy Realtime PCR: Biorad IQ5, ABI 7500; máy spin, máy vortex, máy ly tâm lạnh. Máy đọc kết quả RT-PCR Cerpheid, Biorad IQ5, ABI 7500.
- Micropipet các cỡ, Multisepper và đầu típ phù hợp; ống eppendorf cĩ thể tích khác nhau.
- Bộ kít chiết tách TACO DNA/RNA EXTRACTION KIT - Đối chứng dương tính (+), đối chứng âm tính (-) H5N6
- Nguyên liệu nhân gen: kít One-Step RT-PCR Qiagen® (Cat No.210210) hoặc Invitrogen One-step RT-PCR (Cat No.11732-020)
- Đoạn mồi (primers) và Đoạn dị (probe) để phát hiện virus:
Bảng 3.1. Trình tự các đoạn mồi và đoạn dị để phát hiện virus H5N6
Tên mồi Kí hiệu mồi/probe Trình tự (5'-3') M-4 (CDC) Probe FAM-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-BHQ1
Mồi xuơi GACCRATCCTGTCACCTCTGAC
Mồi ngược AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA
H5-9S
Mồi xuơi ACATATGACTACCCACARTATTCAG
Probe FAM-TCAACAGTGGCGAGTTCCCTAGCA-BHQ1
Mồi ngược 1 AGACCAGCTAYCATGATTGC
Mồi ngược 2 AAACCAGCCACTATGATTGC
N6-1
Mồi xuơi CCCCACCAATGGGAACTG
Probe FAM-CCAATAACAGGAGGGAGCCCAGACCC-BHQ1
3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.1. Phương pháp dịch tễ học mơ tả, dịch tễ học phân tích
Áp dụng cho điểu tra tình hình chăn nuơi gia cầm, cơng tác tiêm phịng vaccine phịng cúm, tình hình dịch cúm gia cầm tại các tỉnh trong giai đoạn từ năm 2010 đến 6 tháng đầu năm 2016.
3.4.2. Phương pháp lấy mẫu
3.4.2.1. Phương pháp lấy mẫu dịch ngốy hầu họng
Dùng tăm bơng vơ trùng đưa sâu vào trong hầu họng của gà, vịt ngốy nhẹ nhàng trên bề mặt niêm mạc, tại mỗi chợ, mỗi lần lấy 30 mẫu dịch ngốy hầu họng của gà và 30 mẫu dịch ngốy hầu họng của vịt sau đĩ cho vào ống nghiệm cĩ chứa dung dịch bảo quản. Gộp 05 mẫu đơn thành 01 mẫu xét nghiệm, gộp ngay tại chợ đưa vào thùng bảo quản lạnh ở 40C rồi vận chuyển về phịng thí nghiệm trong vịng 48h kể từ khi lấy mẫu.
3.4.2.2. Phương pháp lấy mẫu mơi trường
Dùng tăm bơng vơ trùng ngốy phân gia cầm, chất thải trên lồng nhốt gia cầm, mẫu nước thải tại khu buơn bán gia cầm, mẫu nước cho gia cầm uống sau đĩ cho vào ống nghiệm cĩ chứa dung dịch bảo. Tại mỗi chợ lấy 1 mẫu phân tươi 2 mẫu chất thải, 2 mẫu nước thải, 2 mẫu nước cho gia cầm uống sau đĩ đưa vào thùng bảo quản lạnh bảo quản ở 40 C và gửi về phịng thí nghiệm trong vịng 48h kể từ khi lấy mẫu.
Trong quá trình lấy mẫu phải đảm bảo đúng kỹ thuật, tránh lây nhiễm chéo giữa các mẫu bệnh phẩm.
3.4.3. Phương pháp xét nghiệm virus cúm A/H5N6
Phương pháp xét nghiệm virus cúm A/H5N6 bằng kỹ thuật Realtime RT- PCR được tiến hành theo quy trình TYV2-HDPP-VR-54 - TCCS 16:2016/TYV2-CĐ của Cơ quan Thú y vùng II theo sơ đồ sau:
Sơ đồ 3.1. Quy trình xét nghiệm phát hiện virus cúm A/H5N6
Đọc kết quả
Điều kiện phản ứng được cơng nhận: Mẫu đối chứng dương (được chuẩn độ trước) cĩ giá trị Ct ≤ 25 (± 2 Ct), mẫu đối chứng âm tính khơng cĩ giá trị Ct.
Với điều kiện như trên, mẫu cĩ giá trị Ct ≤ 35 được coi là dương tính. Mẫu khơng cĩ Ct là âm tính. Mẫu cĩ giá trị 35< Ct ≤ 40 được coi là nghi ngờ.
Những mẫu nghi ngờ cần được xét nghiệm lại bằng phương pháp khác (phân lập virus) để khẳng định.
3.4.4. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu dịch bệnh được tổng hợp và vẽ bản đồ bằng phần mềm vẽ bản đồ dịch tễ ArcGIS 9.3.
Kết quả xét nghiệm được nhập và xử lý qua MS. Excel, phần mềm WinEpiscope 2.0. tính tỷ lệ dương tính xét nghiệm (tỷ lệ nhiễm p ) tính theo cơng thức:
trong đĩ a là số mẫu dương tính; n là tổng số mẫu xét nghiệm).Ước tính tỷ lệ nhiễm trong quần thể (P) với độ tin cậy 95% được theo cơng thức:
P = p ± 1,96 x SE trong đĩ SE là sai số chuẩn được tính theo cơng thức: