2.5.1. Kết quả giám sát
Kể từ khi xuất hiện tại nước ta, dịch cúm gia cầm đã ảnh hưởng rất nhiều tới nước ta kể về kinh tế, chính trị, văn hĩa và xã hội. Chính vì vậy việc chủ động các biện pháp phịng bệnh luơn được Đảng và Nhà nước quan tâm. Bên cạnh đĩ, chúng ta cũng đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của các tổ chức trên thế giới như FAO, VAHIP, CDC, USAID, ... qua rất nhiều chương trình giám sát chủ động nhằm phát hiện sự lưu hành của các chủng virus trong cả nước qua đĩ điều chỉnh các biện pháp phịng chống dịch cho phù hợp. Sơ lược kết quả hoạt động giám sát cúm gia cầm tại nước ta giai đoạn 2008 – 2016 như sau:
- Đối với hoạt động giám sát chủ động cúm gia cầm H5N1: Qua các dự án và ở các giai đoạn khác nhau tại nước ta đều phát hiện cĩ sự lưu hành của virus cúm gia cầm A/H5N1với tỷ lệ khá cao. Cụ thể trong tổng số 48.349 mẫu xét nghiệm đã phát hiện 1.782 mẫu bệnh phẩm dương tính với virus cúm gia cầm A/H5N1 (3,69%) trong đĩ ở dự án VAHIP trong tổng số 22.745 mẫu bệnh phẩm cĩ 680 mẫu dương tính với virus cúm A/H5N1 (2,99%); Ở dự án do FAO tài trợ cĩ 1.102/25.604 mẫu bệnh phẩm dương tính với virus cúm A/H5N1 (4,3%). Từ tháng 12/2015 đến tháng 2/2016 tiếp tục lẫy 3.840 mẫu bệnh phẩm tại các chợ buơn bán gia cầm sống kết quả cĩ 34/3.084 mẫu bệnh phẩm dương tính với virus cúm A/H5N1 (1,10%) (Phạm Thành Long, 2016).
- Đối với giám sát lưu hành virus cúm A/H7N9 trên đàn gia cầm nhập lậu và tại các chợ buơn bán gia cầm sống: Từ tháng 6/2013 đến tháng 2/2015 đã xét nghiệm 171.250 mẫu bệnh phẩm tại các tỉnh Biên giới phía Bắc nước ta (Hà Giang, Lào Cai, Cao Bằng, Lạng Sơn và Quảng Ninh) và các điểm trung chuyển, chợ buơn bán gia cầm lớn tại Hà Nội, Hưng Yên, Bắc Ninh, Bắc Giang. Kết quả chưa phát hiện mẫu bệnh phẩm nào dương tính với virus cúm A/H7N9. Từ tháng 12/2015 đến tháng 2/2016 tiếp tục lấy 3.084 mẫu bệnh phẩm tại các chợ buơn bán gia cầm sống kết quả vẫn chưa phát hiện sự cĩ mặt của virus cúm A/H7N9 trên lãnh thổ Việt Nam (Phạm Thành Long, 2016).
- Đối với giám sát lưu hành virus cúm gia cầm A/H5N6: từ 12/2015 đến tháng 2/2016 đã triển khai chương trình giám sát lưu hành virus cúm gia cầm H5N6 tại 68 chợ buơn bán gia cầm ở 60 huyện, 32 tỉnh trong cả nước. Tổng số mẫu bệnh phẩm thu thập là 3.084 mẫu (mẫu gộp). Kết quả xét nghiệm cho thấy cĩ 108/3.084 mẫu dương tính với virus cúm A/H5N6 (3,50%) (Phạm Thành Long, 2016).
2.5.2. Kết quả phân tích virus cúm gia cầm tại Việt Nam
Để làm tốt cơng tác phịng, chống bệnh cúm gia cầm độc lực cao, ngồi việc xác định tỷ lệ lưu hành tại các địa phương trong cả nước thì cơng tác nghiên cứu, giải trình tự gen của virus để qua đĩ lựa chọn loại vaccine phù hợp cho cơng tác tiêm phịng trong cả nước. Kể từ khi dịch cúm gia cầm xuất hiện tại nước ta tới nay, virus cúm luơn luơn thay đổi về cấu trúc tạo ra các chủng virus mới cĩ độc lực cao gây nhiều khĩ khăn cho cơng tác phịng chống dịch tại các địa phương. Quá trình biến đổi của các chủng virus cúm tại Việt Nam từ 2003 đến nay được thể hiện qua bảng sau:
Bảng 2.3. Tĩm tắt các chủng virus cúm gia cầm tại Việt Nam, 2003 - 2016
Năm Miền Bắc Miền Nam
2003 - 2005 Virus H5N1 xâm nhập vào Việt Nam Clade 1
2007 - 2008 Xuất hiện Clade 2.3.4 thay thế clade 1;
Clade 7 được phát hiện trên gà nhập lậu
Clade 1 phổ biến và cĩ những biến đổi.
Clade 2.3.2/2.3.4 thỉnh thoảng được phát hiện.
2009 Phát hiện được nhiều nhánh của clade
2.3.4
2010 Xuất hiện clade 2.3.2 giống với chủng
phát hiện tại Mơng Cổ, Hong Kong.
2011 -2013 Biến đổi từ clade2.3.4 sang 2.3.2.1 với
3 nhánh phụ A, B, C
2014 Clade 2.3.2.1C là chủ yếu
Xuất hiện virus H5N6 (Clade 2.3.4.4)
Clade 2.3.2.1C phổ biến
Clade 1.1 cĩ tại một vài ổ dịch
2015 - nay H5N6 Clade 2.3.4.4 lưu hành chủ yếu H5N1 Clade 2.3.2.1C phổ
biến
Nguồn: Phạm Thành Long (2016)
2.6. CƠNG TÁC PHỊNG, CHỐNG BỆNH CÚM Ở GIA CẦM
Tại nước ta hiện nay, bệnh cúm gia cầm thể độc lực cao là 1 trong 5 bệnh ưu tiên phối hợp liên ngành giữa y tế và thú y trong việc điều tra, giám sát, chia sẻ thơng tin và nghiên cứu khoa học theo Thơng tư 16/2013/TTLT-BYT- BNNPTNT. Đối với cơng tác xử lý các ổ dịch cúm gia cầm thực hiện theo Thơng tư 07/2016/TT-BNNPTNT ngày 31/5/2016 của Bộ Nơng nghiệp và PTNT quy định về phịng, chống dịch bệnh động vật trên cạn.
Đối với dịch cúm A/H7N9 thực hiện theo Quyết định số 210/QĐ-BNN-TY ngày 14/02/2014 của Bộ Nơng nghiệp và PTNT về việc Ban hành Kế hoạch hành động ứng phĩ khẩn cấp với các chủng virus cúm nguy hiểm cĩ khả năng lây lan sang người.
Trong điều kiện chăn nuơi gia cầm như ở Việt Nam hiện nay, để kiểm sốt dịch cúm gia cầm, một biện pháp rất quan trọng là tạo miễn dịch chủ động bằng cách tiêm vacxin cho đàn gia cầm. Theo kết quả nghiên cứu mới nhất, hiện nay
tại nước ta lưu hành 2 chủng virus cúm gia cầm chủ yếu là virus cúm A/H5N1 thuộc nhánh 2.3.2.1C và virus cúm A/H5N6 thuộc nhánh 2.3.4.4 (Cục Thú y , 2016). Do đĩ các loại vaccine được sử dụng cho cơng tác tiêm phịng hiện nay là: - Vaccine cúm gia cầm H5N1 Navet-Vifluvac sử dụng để phịng bệnh cúm gia cầm do virus cúm A/H5N1 nhánh 1, A/H5N1 nhánh 2.3.2.1C và A/H5N6 nhánh 2.3.4.4 gây ra.
- Vaccine cúm H5N1 Re-6 sử dụng để phịng bệnh cúm gia cầm do virus cúm A/H5N1 nhánh 2.3.2.1C gây ra.
- Vaccine H5N1 Re-5 cĩ thể phịng bệnh cúm gia cầm do virus cúm A/H5N1 nhánh 1 và virus cúm A/H5N6 nhánh 2.3.4.4 gây ra.
Bên cạnh đĩ cần tăng cường hoạt động giám sát chủ động đặc biệt là tại các tỉnh vùng biên giới, các chợ buơn bán, các điểm thu gom gia cầm sống để phát hiện thêm các chủng virus mới cũng như xác định sự lưu hành của virus tại các địa phương qua đĩ đưa ra các cảnh báo sớm, các khuyến cáo kịp thời trong cơng tác phịng chống dịch.
2.7. NGUYÊN LÝ KỸ THUẬT REALTIME PCR
Kỹ thuật Realtime PCR là một kỹ thuật PCR sử dụng các đặc điểm của quá trình sao chép DNA. Trong kỹ thuật PCR truyền thống, sản phẩm khuyếch đại được phát hiện qua phân tích điểm kết thúc bằng cách điện di DNA trên gel agarose khi phản ứng kết thúc. Ngược lại, Realtime PCR cho phép phát hiện và định lượng sự tích lũy DNA khuếch đại ngay khi phản ứng đang xảy ra. Khả năng này được phát hiện nhờ bổ sung vào phản ứng những phân tử phát huỳnh quang. Những hĩa chất phát huỳnh quang bao gồm thuốc nhuộm liên kết DNA và những trình tự gắn huỳnh quang liên kết đặc hiệu với Primer gọi là Probe. Khi DNA tương hợp với primer thì quá trình sao chép sẽ xảy ra và sự gia tăng lượng tín hiệu huỳnh quang tỷ lệ với sự gia tăng lượng DNA. Ban đầu, tín hiệu huỳnh quang cịn ở tín hiệu nền ta khơng thể phát hiện sự gia tăng tín hiệu cho dù cĩ quá trình khuếch đại và sản phẩm đã tăng theo hàm mũ. Đến một thời điểm xác định, sản phẩm khuếch đại đã tạo ra đủ tín hiệu huỳnh quang cĩ thể phát hiện được. Chu kỳ này được gọi là chu kỳ ngưỡng CT (Cycle of threshold). Đây cũng là giá trị để đánh giá kết quả phản ứng.
Cúm gia cầm cĩ vật chất di truyền là RNA nên trong kỹ thuật Realtime PCR cĩ thêm quá trình sao chép ngược từ RNA → DNA gọi là Reverse
transcription nên phương pháp này được gọi là Realtime RT–PCR.
Nguyên lí hoạt động của Probe: Cĩ nhiều loại hĩa chất phát huỳnh quang dựa trên Primer và Probe, hĩa chất được sử dụng cho kỹ thuật Realtime RT–PCR phát hiện virus Cúm gia cầm tại Cơ quan Thú y vùng II là Taqman Probe.
.
Sơ đồ 2.2. Cơ chế hoạt động của Taqman probe
Taqman probe được sử dụng như một trình tự oligonucleotide đặc hiệu, gắn chất huỳnh quang gọi là mẫu dị Taqman probe, cùng với các primer.
Taqman probe gắn một chất phát huỳnh quang ở đầu 5’ (reporter) và một chất hấp phụ huỳnh quang ở đầu 3’ (quencher). Khi cịn nguyên vẹn, tín hiệu của chất phát huỳnh quang bị hấp thụ do nĩ nằm gần chất hấp phụ. Trong giai đoạn kết hợp bắt gặp và kéo dài DNA trong phản ứng khuếch đại, probe liên kết với trình tự đích và hoạt động 5’ – 3’ exonuclease đặc hiệu cho DNA mạch đơi của Taq sẽ cắt đứt đầu gắn chất huỳnh quang. Kết quả chất huỳnh quang bị tách khỏi chất hấp phụ và tín hiệu huỳnh quang phát ra tỷ lệ với lượng sản phẩm khuếch đại trong mẫu.
PHẦN 3. NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Virus cúm A/H5N6 trong các mẫu dịch ngốy hầu họng của gà và vịt; mẫu mơi trường (mẫu phân tươi, mẫu nước thải, mẫu nước uống, mẫu chất thải trên lơng nhốt gia cầm) tại 12 chợ buơn bán gia cầm sống ở 3 tỉnh: Hải Phịng (các chợ Lương Văn Can, Quán Toan, Đầm Triều và chợ Thị trấn Tiên Lãng), Lạng Sơn (các chợ Đồng Đăng, Thất Khê, Hội Hoan và Na Dương) và Quảng Ninh (các chợ Minh Thành, Rừng, Địa Chất và Cái Răm).
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Tình hình chăn nuơi gia cầm tại các tỉnh từ 2010 – 6 tháng đầu năm 2016. Kết quả tiêm vaccine cúm gia cầm tại các tỉnh từ 2010 – 6 tháng đầu năm 2016.
Tình hình dịch cúm gia cầm tại các tỉnh từ 2010 - 6 tháng đầu năm 2016. Nghiên cứu lưu hành virus cúm A/H5N6 tại các chợ.
- Nghiên cứu tỷ lệ nhiễm virus cúm type A trong các mẫu bệnh phẩm. - Nghiên cứu tỷ lệ nhiễm virus cúm subtype H5 trong các mẫu bệnh phẩm. - Nghiên cứu tỷ lệ nhiễm virus cúm subtype N6 trong các mẫu bệnh phẩm. - Nghiên cứu lưu hành virus cúm A/H5N6 qua các vịng lấy mẫu.
- Nghiên cứu lưu hành virus cúm A/H5N6 tại các chợ lấy mẫu.
3.3. NGUYÊN LIỆU 3.3.1. Mẫu thí nghiệm 3.3.1. Mẫu thí nghiệm
Mẫu dịch ngốy hầu họng của gà, vịt và mẫu mơi trường tại 12 chợ đã được lựa chọn.
3.3.2. Dụng cụ, hĩa chất lấy mẫu, thiết bị, hĩa chất xét nghiệm
3.3.2.1. Dụng cụ lấy mẫu
Bảo hộ lao động, tăm bơng vơ trùng, ống đựng mẫu, thùng bảo quản mẫu, nhãn dán mẫu, phiếu ghi thơng tin, túi đựng mẫu, thuốc sát trùng, găng tay,...
3.3.2.2. Hĩa chất, trang thiết bị xét nghiệm.
a. Mơi trường bảo quản mẫu: Mơi trường PBS - Glycerol
b. Dụng cu, hĩa chất cho xét nghiệm mẫu bệnh phẩm
- Máy Realtime PCR: Biorad IQ5, ABI 7500; máy spin, máy vortex, máy ly tâm lạnh. Máy đọc kết quả RT-PCR Cerpheid, Biorad IQ5, ABI 7500.
- Micropipet các cỡ, Multisepper và đầu típ phù hợp; ống eppendorf cĩ thể tích khác nhau.
- Bộ kít chiết tách TACO DNA/RNA EXTRACTION KIT - Đối chứng dương tính (+), đối chứng âm tính (-) H5N6
- Nguyên liệu nhân gen: kít One-Step RT-PCR Qiagen® (Cat No.210210) hoặc Invitrogen One-step RT-PCR (Cat No.11732-020)
- Đoạn mồi (primers) và Đoạn dị (probe) để phát hiện virus:
Bảng 3.1. Trình tự các đoạn mồi và đoạn dị để phát hiện virus H5N6
Tên mồi Kí hiệu mồi/probe Trình tự (5'-3') M-4 (CDC) Probe FAM-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-BHQ1
Mồi xuơi GACCRATCCTGTCACCTCTGAC
Mồi ngược AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA
H5-9S
Mồi xuơi ACATATGACTACCCACARTATTCAG
Probe FAM-TCAACAGTGGCGAGTTCCCTAGCA-BHQ1
Mồi ngược 1 AGACCAGCTAYCATGATTGC
Mồi ngược 2 AAACCAGCCACTATGATTGC
N6-1
Mồi xuơi CCCCACCAATGGGAACTG
Probe FAM-CCAATAACAGGAGGGAGCCCAGACCC-BHQ1
3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.1. Phương pháp dịch tễ học mơ tả, dịch tễ học phân tích
Áp dụng cho điểu tra tình hình chăn nuơi gia cầm, cơng tác tiêm phịng vaccine phịng cúm, tình hình dịch cúm gia cầm tại các tỉnh trong giai đoạn từ năm 2010 đến 6 tháng đầu năm 2016.
3.4.2. Phương pháp lấy mẫu
3.4.2.1. Phương pháp lấy mẫu dịch ngốy hầu họng
Dùng tăm bơng vơ trùng đưa sâu vào trong hầu họng của gà, vịt ngốy nhẹ nhàng trên bề mặt niêm mạc, tại mỗi chợ, mỗi lần lấy 30 mẫu dịch ngốy hầu họng của gà và 30 mẫu dịch ngốy hầu họng của vịt sau đĩ cho vào ống nghiệm cĩ chứa dung dịch bảo quản. Gộp 05 mẫu đơn thành 01 mẫu xét nghiệm, gộp ngay tại chợ đưa vào thùng bảo quản lạnh ở 40C rồi vận chuyển về phịng thí nghiệm trong vịng 48h kể từ khi lấy mẫu.
3.4.2.2. Phương pháp lấy mẫu mơi trường
Dùng tăm bơng vơ trùng ngốy phân gia cầm, chất thải trên lồng nhốt gia cầm, mẫu nước thải tại khu buơn bán gia cầm, mẫu nước cho gia cầm uống sau đĩ cho vào ống nghiệm cĩ chứa dung dịch bảo. Tại mỗi chợ lấy 1 mẫu phân tươi 2 mẫu chất thải, 2 mẫu nước thải, 2 mẫu nước cho gia cầm uống sau đĩ đưa vào thùng bảo quản lạnh bảo quản ở 40 C và gửi về phịng thí nghiệm trong vịng 48h kể từ khi lấy mẫu.
Trong quá trình lấy mẫu phải đảm bảo đúng kỹ thuật, tránh lây nhiễm chéo giữa các mẫu bệnh phẩm.
3.4.3. Phương pháp xét nghiệm virus cúm A/H5N6
Phương pháp xét nghiệm virus cúm A/H5N6 bằng kỹ thuật Realtime RT- PCR được tiến hành theo quy trình TYV2-HDPP-VR-54 - TCCS 16:2016/TYV2-CĐ của Cơ quan Thú y vùng II theo sơ đồ sau:
Sơ đồ 3.1. Quy trình xét nghiệm phát hiện virus cúm A/H5N6
Đọc kết quả
Điều kiện phản ứng được cơng nhận: Mẫu đối chứng dương (được chuẩn độ trước) cĩ giá trị Ct ≤ 25 (± 2 Ct), mẫu đối chứng âm tính khơng cĩ giá trị Ct.
Với điều kiện như trên, mẫu cĩ giá trị Ct ≤ 35 được coi là dương tính. Mẫu khơng cĩ Ct là âm tính. Mẫu cĩ giá trị 35< Ct ≤ 40 được coi là nghi ngờ.
Những mẫu nghi ngờ cần được xét nghiệm lại bằng phương pháp khác (phân lập virus) để khẳng định.
3.4.4. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu dịch bệnh được tổng hợp và vẽ bản đồ bằng phần mềm vẽ bản đồ dịch tễ ArcGIS 9.3.
Kết quả xét nghiệm được nhập và xử lý qua MS. Excel, phần mềm WinEpiscope 2.0. tính tỷ lệ dương tính xét nghiệm (tỷ lệ nhiễm p ) tính theo cơng thức:
trong đĩ a là số mẫu dương tính; n là tổng số mẫu xét nghiệm).Ước tính tỷ lệ nhiễm trong quần thể (P) với độ tin cậy 95% được theo cơng thức:
P = p ± 1,96 x SE trong đĩ SE là sai số chuẩn được tính theo cơng thức:
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. TÌNH HÌNH CHĂN NUƠI GIA CẦM TẠI CÁC TỈNH TỪ 2010 – 6 THÁNG ĐẦU NĂM 2016 THÁNG ĐẦU NĂM 2016
Từ trước tới nay, ngành chăn nuơi đặc biệt là chăn nuơi gia cầm luơn đĩng một vai trị vơ cùng quan trọng trong phát triển kinh tế đất nước. Theo số liệu của Tổng Cục Thống kê, năm 2015 cả nước cĩ khoảng 341,9 triệu con gia cầm các loại trong đĩ tập trung tại các tỉnh đồng bằng Sơng Hồng và đồng bắng Sơng Cửu Long, sản lượng thịt ước đạt hơn 908 nghìn tấn, sản lượng trứng đạt 8,87 tỷ quả. Cùng với sự tăng lên về tổng đàn gia cầm thì phương thức chăn nuơi cũng cĩ một bước dịch chuyển lớn từ chăn nuơi nơng hộ nhỏ lẻ tự cung, tự cấp sang chăn nuơi theo hướng trang trại cơng nghiệp, hàng hĩa, tập trung. Nhiều thành tựu khoa học kỹ thuật đã được áp dụng vào chăn nuơi gia cầm nhằm nâng cao năng suất, chất lượng của trứng, thịt đáp ứng nhu cầu tiêu dùng trong nước và hướng tới xuất khẩu. Cũng khơng nằm ngồi xu thế đĩ, tại các tỉnh Hải Phịng, Lạng Sơn và Quảng Ninh chăn nuơi gia cầm cũng đang nhận được sự quan tâm của chính quyền các cấp và sự đầu tư của các tập đồn kinh tế. Tình hình chăn nuơi gia cầm tại các tỉnh này từ 2010 - 6 tháng đầu năm 2016 được thể hiện qua biểu đồ 4.1, chi tiết ở phụ lục 4.1.