Phần 2 Tổng quan tài liệu
2.7. Nguyên lý kỹ thuật REALTIME PCR
Kỹ thuật Realtime PCR là một kỹ thuật PCR sử dụng các đặc điểm của quá trình sao chép DNA. Trong kỹ thuật PCR truyền thống, sản phẩm khuyếch đại được phát hiện qua phân tích điểm kết thúc bằng cách điện di DNA trên gel agarose khi phản ứng kết thúc. Ngược lại, Realtime PCR cho phép phát hiện và định lượng sự tích lũy DNA khuếch đại ngay khi phản ứng đang xảy ra. Khả năng này được phát hiện nhờ bổ sung vào phản ứng những phân tử phát huỳnh quang. Những hĩa chất phát huỳnh quang bao gồm thuốc nhuộm liên kết DNA và những trình tự gắn huỳnh quang liên kết đặc hiệu với Primer gọi là Probe. Khi DNA tương hợp với primer thì quá trình sao chép sẽ xảy ra và sự gia tăng lượng tín hiệu huỳnh quang tỷ lệ với sự gia tăng lượng DNA. Ban đầu, tín hiệu huỳnh quang cịn ở tín hiệu nền ta khơng thể phát hiện sự gia tăng tín hiệu cho dù cĩ quá trình khuếch đại và sản phẩm đã tăng theo hàm mũ. Đến một thời điểm xác định, sản phẩm khuếch đại đã tạo ra đủ tín hiệu huỳnh quang cĩ thể phát hiện được. Chu kỳ này được gọi là chu kỳ ngưỡng CT (Cycle of threshold). Đây cũng là giá trị để đánh giá kết quả phản ứng.
Cúm gia cầm cĩ vật chất di truyền là RNA nên trong kỹ thuật Realtime PCR cĩ thêm quá trình sao chép ngược từ RNA → DNA gọi là Reverse
transcription nên phương pháp này được gọi là Realtime RT–PCR.
Nguyên lí hoạt động của Probe: Cĩ nhiều loại hĩa chất phát huỳnh quang dựa trên Primer và Probe, hĩa chất được sử dụng cho kỹ thuật Realtime RT–PCR phát hiện virus Cúm gia cầm tại Cơ quan Thú y vùng II là Taqman Probe.
.
Sơ đồ 2.2. Cơ chế hoạt động của Taqman probe
Taqman probe được sử dụng như một trình tự oligonucleotide đặc hiệu, gắn chất huỳnh quang gọi là mẫu dị Taqman probe, cùng với các primer.
Taqman probe gắn một chất phát huỳnh quang ở đầu 5’ (reporter) và một chất hấp phụ huỳnh quang ở đầu 3’ (quencher). Khi cịn nguyên vẹn, tín hiệu của chất phát huỳnh quang bị hấp thụ do nĩ nằm gần chất hấp phụ. Trong giai đoạn kết hợp bắt gặp và kéo dài DNA trong phản ứng khuếch đại, probe liên kết với trình tự đích và hoạt động 5’ – 3’ exonuclease đặc hiệu cho DNA mạch đơi của Taq sẽ cắt đứt đầu gắn chất huỳnh quang. Kết quả chất huỳnh quang bị tách khỏi chất hấp phụ và tín hiệu huỳnh quang phát ra tỷ lệ với lượng sản phẩm khuếch đại trong mẫu.