Phần 2 Tổng quan tài liệu
2.6. Các phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật trong thịt và sản phẩm thịt
VÀ SẢN PHẨM THỊT
QCVN 8-3:2012/BYT ban hành nêu rõ các chỉ tiêu vi sinh vật cần phải kiểm nghiệm đối với mỗi loại thực phẩm. Với các sản phẩm thịt 3 chỉ tiêu cần kiểm tra: tổng số VSVHK, E.coli và Salmonella đồng thời quy định rõ mức giới hạn được phép có mặt trong sản phẩm và khơng được phép có mặt trong sản phẩm. Việc không quy định phương pháp xét nghiệm giúp cho các phịng thí nghiệm có cơ hội cải tiến, ứng dụng các kỹ thuật mới vào công tác kiểm nghiệm sao cho phù hợp với điều kiện cơ sở vật chất ở từng cơ quan.
2.6.1. Một số phương pháp định lượng tổng số VSVHK
Có nhiều cách xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí: Phương pháp đếm trực tiếp, phương pháp đếm khuẩn lạc, phương pháp đo độ đục, phương pháp đếm khuẩn lạc trên màng lọc, phương pháp MPN. Trong số các phương pháp kể trên, phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch đang là phương pháp được lựa chọn và áp dụng rộng dãi hơn cả. Phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch đã
được ISO ban hành thành tiêu chuẩn số 4833(ISO 4833-1,2, 2013) và được chuyển sang TCVN số 4884-1,2:2013. Phạm vi áp dụng trong 2 phiên bản bao trùm hầu hết các loài vi khuẩn khác nhau: loài ưa nhiệt, ưa lạnh, nhạy cảm nhiệt…các nhóm sản phẩm khác nhau. Mỗi phiên bản có ưu và nhược điểm riêng, việc lựa chọn phiên bản phù hợp để định lượng nhóm đối tượng trong các mẫu kiểm nghiệm góp phần làm giảm đáng kể sai lệch kết quả, các giá trị không mong muốn trong cơng tác kiểm nghiệm. Ngồi ISO, AOAC cũng xây dựng tiêu chuẩn định lượng tổng số VSVHK trên đĩa thạch nhưng sử dụng các nguyên liệu đông khô (đĩa petrifilm). Tiêu chuẩn AOAC 990.12 được chuyển thành TCVN 9977:2013 và được nhiều phịng thí nghiệm tại Việt Nam lựa chọn sử dụng trong công tác kiểm nghiệm mẫu. Do có nhiều ưu điểm: giảm đáng kể thời gian chuẩn bị môi trường, tiết kiệm không gian tủ nuôi cấy (trong trường hợp phịng thí nghiệm có diện tích nhỏ), tiết kiệm chi phí điện, nước, nhân cơng và góp phần vào việc bảo vệ môi trường.
2.6.2. Một số phương pháp định lượng E.coli
Escherichia coli là vi khuẩn được lựa chọn là sinh vật chỉ thị để đánh giá
mức độ ô nhiễm phân trong công tác đánh giá vệ sinh thú y. Việc đánh giá mức độ vệ sinh của sản phẩm gián tiếp qua thông số định lượng số lượng khuẩn lạc có trong sản phẩm. Phương pháp định lượng E.coli trong các mẫu thực phẩm được ứng dụng ở nhiều phịng thí nghiệm: Phương pháp đếm số có xác suất lớn nhất (phương pháp MPN), phương pháp nhiều ống dựa trên đặc tính lên men đường lactose và có sinh khí ở 440C của vi khuẩn E.coli (TCVN 6846, 2007), (ISO
7251, 2005), hay khả năng sinh màu vàng (tạo axit) trong mơi trường glutamate khống cải biến (TCVN 7924-3, 2008), (ISO 166493, 2005).
Lựa chọn phương pháp MPN trong xét nghiệm mẫu là chấp nhận sự biến động lớn của kết quả do độ nhạy chủa phương pháp.
Phương pháp định lượng bằng kỹ thuật đổ đĩa hoặc sử dụng màng lọc. Phương pháp màng lọc (màng xelulo axetat) cho phép phát hiện E.coli (tuýp sinh học 1) và các biến thể không lên men lactase và phát triển kị khí (TCVN 7135, 2002), hay E.coli dương tính beta-gluccuronidaza (TCVN 7924-1, 2008).
Phương pháp đổ đĩa có sử dụng mơi trường có chứa thành phần tạo sắc (thạch trypton- mật –glucuronid) để nhận nhận biết sự có mặt của vi khuẩn E.coli dương tính beta –glucuronidaza (TCVN 7924:2, 2008).
20
2.6.3. Phương pháp phát hiện Salmonella
Salmonella, vi khuẩn gây bệnh và gây ngộ độc thực phẩm khơng được
phép có mặt trong các loại thực phẩm. Có nhiều phương pháp phát hiện, xác định sự có mặt của lồi vi khuẩn này: Phương pháp nuôi cấy truyền thống sử dụng các môi trường muôi cấy cần phải trải qua 4 giai đoạn kế tiếp nhau: Từ tăng sinh ban đầu trong môi trường dinh dưỡng (buffer peptone water) đến tăng sinh chọn lọc trên các mơi trường lỏng có bổ sung các yếu tố hạn chế sự phát triển của các loài vi khuẩn khác (Muller- Kauffmann, Rappaport- Vassiliadis, Selenit…), sau bước tăng sinh chọn lọc đến bước phát hiện và khẳng định trên môi trường đặc chọn lọc (Deoxycholat lyzin xyloza, Hoktoen enteric agar, Brilliant green phenol red lactose sacrose agar) và các mơi trường thử phản ứng sinh hóa (TCVN 4829, 2005; TCVN 6402, 2007), (ISO 6579, 2002; ISO 6785, 2001).
Hiện nay việc cải tiến kỹ thuật theo phương pháp nuôi cấy được nghiên cứu bằng việc gộp 2 bước tăng sinh cơ bản và tăng sinh chọn lọc chỉ còn một bước gộp, với cải tiến này việc phát hiện Salmonella trong thực phẩm giảm được đáng kể thời gian cho ra kết quả: từ 72-96 giờ giảm xuống còn 37 giờ.
Phương pháp sinh học phân tử (Các kỹ thuật PCR, realtime PCR, Multiplex PCR…) dựa trên nguyên lý phát hiện đoạn gen đặc trưng của
Salmonella bằng chuỗi phản ứng trùng hợp AND.
Phương pháp phát hiện Salmonella dựa vào phản ứng ELISA: nguyên lý dựa vào sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể trong phản ứng được thực hiện trên phiến kính.
Phương pháp dựa vào phage để phát hiện sự có mặt của Salmonella, phage có thể là một đoạn gen từ vi sinh vật hoặc cũng có thể được tổng hợp nhân tạo, phương pháp này cho phép phát hiện Salmonella sau 18-24 giờ trong môi trường làm giàu không chọn lọc. Đây là phương pháp mới nhưng hứa hẹn cách thức tiếp cận, mở ra nghiên cứu mới trong việc phát hiện Salmonella (Joseph A. Odumeru and Carlos G. León-Velarde, 2012).