3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là một số vi khuẩn gây ô nhiễm trong thịt đông lạnh nhập khẩu (quy định trong QCVN 8-3/ BYT) và các tiêu chuẩn sử dụng để xét nghiệm.
- Tổng số VSVHK – TCVN 9977:2013
- E.coli – TCVN 9975: 2013
- Salmonella spp – TCCS 03/TYV2/2016-CĐ
3.1.2. Địa điểm nghiên cứu
Phòng Vi sinh thực phẩm - Tổ Vệ sinh thú y - Trạm Chẩn đoán xét nghiệm bệnh động vật, Cơ quan Thú y vùng II.
Thời gian thực hiện đề tài: từ tháng 8/2016 đến tháng 6/2017.
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.2.1. Xác định giá trị sử dụng của phương pháp
- Thẩm định phương pháp đinh lượng tổng số VSVHK trong thịt theo TCVN 9977-2013
- Thẩm định phương pháp đinh lượng vi khuẩn E.coli trong thịt theo TCVN 9975-2013
- Thẩm định (xác nhận giá trị sử dụng) phương pháp phát hiện Salmonella
spp trong thịt theo TCCS 03/2016/TYV2-CĐ
3.2.2. Ứng dụng Kiểm nghiệm một số mẫu thịt đông lạnh nhập khẩu
- Kiểm nghiệm các lô thịt bò đông lạnh - Kiểm nghiệm các lô thịt đùi gà đông lạnh
- Kiểm nghiệm các lô thịt gà nguyên con đông lạnh
3.3. NGUYÊN LIỆU
3.3.1. Chủng chuẩn vi sinh vật
- Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis ATCC® 49223™*,
22
- Vibrio parahaemolyticus ATCC®. 17802TM
- Staphylococus aureus subsp aureus ATCC®. 29213TM
3.3.2. Các mâũ thịt đông lạnh:
- Các mẫu thịt đông lạnh nhập khẩu đủ điều kiện để làm xét nghiệm: được đóng gói, liêm phong cẩn thận và giữ lạnh ở âm 200C khi nhận tại phòng xét nghiệm vi sinh. Bao gồm: mẫu thịt gà xay, mẫu thịt bò, gà nguyên con, và đùi gà.
3.3.3. Các thiết bị trong phòng thí nghiệm
- Tủ âm sâu(-200 C), tủ ấm các loại, tủ sấy, tủ lạnh, nồi hấp cách thủy, cân, buồng cấy an toàn sinh học, máy dập mẫu stomatcher.
- Ống lưu giữ chủng chuẩn thương mại Microbank, đèn cồn, que cấy nhựa vô trùng dùng một lần, hộp lồng thủy tinh, khay men, cốc đong, ống nghiệm, dao mổ, kéo cong...
- Hệ thống định danh Vitek 2 compact.
3.3.4. Môi trường chính nuôi cấy vi sinh vật
Bảng 3.1. Môi trường chính dùng để thẩm định phương pháp và phân tích các chỉ tiêu VSV TT Chỉ tiêu phân tích/Phương pháp Môi trường chính 1 TSVSVHK (TCVN9977:2013)
Đĩa đếm vi sinh vật hiếu khí 3M PetrifilmTM Aerobic count plate
2 E.coli (TCVN9975:2013) Đĩa đếm 3M PetrifilmTM E. coli/coliform count plate
3 Salmonella spp (TCCS
03:2016/TYV2-CĐ)
Buffer peptone water (BPW), Iris Salmonella
supplement(BS 07708), Iris Salmonella agar, confirm’ Salmonella (BT01108)
4 Salmonella spp
TCVN 4884:2015
MKTTn - Tetrathionat/novobioxin Muller kauffman, RVS - Rappaport Vassiliadis, thạch XLD -
Deoxycholat lyzin xyloza, HE - Hektoen enteric agar, TSA (Tryp Soy agar), KHT O, H đa giá
Đĩa đếm vi sinh vật hiếu khí PetrifilmTM : Màng nền của đĩa chứa thạch, chất tạo đông tan được trong nước lạnh, màng phủ của đĩa chứa chất tạo đông
cùng với chất chỉ thị 2,3,5-triphenyltetrazolium clorua để tăng khả năng quan sát sự phát triển của khuẩn lạc. Vùng sinh trưởng được khoanh tròn trên mỗi đĩa chứa khoảng hai mươi ô vuông, mỗi ô có diện tích 1 cm2 trên màng nền.
Đĩa đếm E. coli/coliform PetrifilmTM : Đĩa chứa các chất dinh dưỡng mật đỏ-tím , chất tạo đông tan được trong nước lạnh, chất chỉ thị 2,3,5- triphenyltetrazolium clorua và chất chỉ thị hoạt độ glucuronidase là 5-brom-4- clo-3-indolyl-ß-D-glucuronid, có thể đếm coliform và E. coli trên cùng một đĩa.Vùng sinh trưởng được khoanh tròn trên mỗi đĩa chứa khoảng hai mươi ô vuông, mỗi ô có diện tích 1 cm2 trên màng nền.
Iris Salmonella agar, môi trường chọn lọc đã được nghiên cứu có tính đặc hiệu cao với việc phát hiện hầu hết Salmonella, bao gồm cả các loài và biến chủng huyết thanh không điển hình.Vì vậy, phát hiện Salmonella typhy và paratyphy, các loài Salmonella dương tính với đường lactose (Salmonella
Senftenberg và phân loài S. arizonae và S. diarizonae), chủng sucrose dương tính được đảm bảo. Môi trường cho phép phát hiện các serovar bất động (S. Pullorum
và S. Gallinarum) hoặc các chủng đơn. IRIS ® Salmonella Agar cũng có thể phát hiện các dòng có ít hoặc không có hoạt tính esterase trên các môi trường khác (Salmonella bongori, Salmonella Dublin và Atento, một số phân loài S. và S.
houtenae diarizonae).
MKTTn, RVS: Môi trường tăng sinh thứ cấp , trong 2 môi trường có một số thành phần có tác dụng ức chế một số loài vi khuẩn không phải là Salmonella
XLD agar, HE agar, Môi trường chọ lọc để phát hiện Salmonella.
3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.4.1. Phương pháp thẩm định tiêu chuẩn 3.4.1. Phương pháp thẩm định tiêu chuẩn
Thẩm định, xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp thử nghiệm được thực hiện theo:
- Trần Cao Sơn 2010, TCVN 9332:2012. Các thông số cần xác định: + Độ lặp lại, độ tái lặp, độ không đảm bảo đo ( phương pháp định lượng) + Giới hạn phát hiện, độ nhạy, độ đặc hiệu, độ đúng (phương pháp định tính) Các bước thẩm định phương pháp:
B1: Đánh giá môi trường được sử dụng trong các phương pháp xét nghiệm.
Với môi trường nuôi cấy dạng đặc tiến hành đánh giá hiệu suất của môi trường theo TCVN 8128: 2015. Hiệu suất môi trường kí hiệu PR%.
24
PR% = NS/N0 PR: Hiệu suất môi trường đánh giá
NS: Số khuẩn lạc trung bình trên môi trường kiểm tra
N0: Số khuẩn lạc trung bình trên môi trường tham chiếu và phải > 100 Cách thực hiện: Lấy 1 hạt giá thể có chứa chủng chuẩn Salmonella enteritidis ATCC®49223™*, Escherichia coli ATCC® 11303™ đã được hoạt hóa và bảo quản trong các ống Microbank ở -200C, tăng sinh trong môi trường Brain Heart Infusion nuôi cấy ở 370C sau 24 giờ. Ria cấy chủng từ các ống tăng sinh trên trên các môi trường TSA tiếp tục ủ ở 370C trong 18-24 giờ. Thực hiện các bước pha loãng, cấy lên các môi trường:
- Môi trường dùng để kiểm tổng số VSVHK 3MTM PetrifilmTM Aerobic count plate với môi trường dinh dưỡng Plate count agar (PCA)
- Môi trường dùng để kiểm Coliform và E.coli 3MTM PetrifilmTM
E.coli/Coliform count plate với môi trường Plate count agar (PCA) - Môi trường Iris Salmonella agar với môi trường Tryptic Soy agar (TSA)
B2: Kiểm tra nền mẫu
- Đối với các mẫu nhiễm tự nhiên (mẫu dương tính): Kiểm tra tính ổn định của mẫu, các vi sinh vật mục tiêu có trong nền mẫu phải ổn định trong các lần kiểm tra.
- Đối với các mẫu sử dụng trong các phương pháp phân tích định tính, các nền mẫu đánh giá cần đảm bảo không nhiễm vi sinh vật mục tiêu (mẫu âm tính).
Thực hiện: Lấy riêng khoảng 1kg thịt bò, 1 kg thịt gà xay cắt nhỏ, đồng nhất riêng từng nền mẫu, mỗi nền mẫu rút ra 5 mẫu, mỗi mẫu có trong lượng 25g,
Kiểm tra tổng VSVHK theo TCVN 4884-1: 2015
Kiểm tra E.coli trong các nền mẫu theo TCVN 7924-2: 2008 Kiểm tra Salmonella trong các nền mẫu theo TCVN 4829: 2005
B3: Kiểm tra chủng chuẩn phục vụ cho việc gây nhiễm
Kiểm tra đặc tính sinh hóa của chủng gây nhiễm để đảm bảo chắc chắn các chủng chuẩn không bị biến đổi trong quá trình lưu giữ, bảo quản. Trong đề tài, sử dụng hệ thống định danh vi khuẩn Vitek 2 để test chủng (các bước chi tiết trong phương pháp định danh vi khuẩn trên hệ thống vitek 2 ở phụ lục 1).
(Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis ATCC® 49223™*,
Escherichia coli ATCC® 11303™, Vibrio parahaemolyticus ATCC®. 17802TM,
Staphylococus aureus subsp aureus ATCC®. 29213TM) được định danh lại bằng hệ thống định danh Vitek2.
Hai chủng Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis ATCC® 49223™*, Escherichia coli ATCC® 11303™ sau khi định danh được so sánh với giấy chứng nhận sinh học từ nhà cung cấp để xem các phản ứng sinh hóa có tương đồng hay không.
Chủng gây nhiễm phải thể hiện các đặc tính nuôi cấy trên các môi trường chọn lọc chuyên biệt (ví dụ: khả năng sinh hơi, lên mem trên môi trường lỏng hay khả năng sinh màu trên các môi trường chọn lọc).
B4: Xác định mật độ vi khuẩn để phục vụ cho việc gây nhiễm vào mẫu thẩm định
Sử dụng phương pháp xác định nồng độ vi sinh vật mục tiêu trong các ống pha loãng từ 100, 10-1….10-n bằng cách thăm dò từng ống trong dãy pha loãng:
Cách thức thực hiện: Lấy một khuẩn lạc của chủng E.coli, Salmonella, sau khi đã được kiểm tra đặc tính sinh hóa và đặc tính nuôi cấy trên môi trường chọn lọc, hòa loãng trong 9ml buffer peptone water được dịch canh khuẩn có nồng độ 100, chuyển 1ml sang ống chứa 9ml buffer peptone water được ống có nồng độ 10-1, thực hiện liên tiếp đến nồng độ 10-7, 10-8.
Xác định nồng độ vi khuẩn trong canh trùng bằng phương pháp cấy trang trên đĩa thạch theo phương pháp TCVN 4884-2:2015: Dùng Micropipep lấy 0,1ml cấy láng lên mặt thạch (có thể là môi trường dinh dưỡng TSA, hoặc một môi trường chọn lọc của vi sinh vật mục tiêu), hoặc 1ml vào đĩa thạch trong trường hợp sử dụng phương pháp đổ đĩa. Thực hiện lặp lại mỗi độ pha loãng trên 2 đĩa. Nuôi cấy trong tủ ấm ở các điều kiện nhiệt độ và thời gian của phương pháp yêu cầu. Sử dụng 2 nồng độ liên tiếp để tính kết quả. Kết quả được tính theo TCVN 6404:2008 (ISO 7218:2007).
B5 Gây nhiễm vi sinh vật vào các mẫu
Bố trí thí nghiệm:
Với phương pháp định lượng:
Sử dụng vi sinh vật để gây nhiễm, hoặc các mẫu nhiễm tự nhiên, tốt nhất nằm trong khoảng phát hiện của phòng thí nghiệm trên các nền mẫu xét nghiệm
26
hàng ngày. Thực hiện gây nhiễm vào tối thiểu 10 mẫu nghiên cứu cho mỗi nền mẫu: 10 mẫu thịt gà xay và 10 mẫu thịt bò, mỗi mẫu 50g được gây nhiễm cùng một lượng vi khuẩn E.coli trong giải nồng độ từ 102 đến 104 CFU/g.
Thực hiện phân tích chỉ tiêu tổng số VSVHK theo TCVN 9977:2013 và TCVN 4884:2015 trên 10 mẫu thịt xay nhiễm tự nhiên, và 10 mẫu thịt bò gây nhiễm chủng E.coli. Đối vơi nền mẫu thịt bò, do số lượng vi sinh vật thấp nên cần phải gây nhiễm thêm một lượng vi khuẩn nhất định vào các mẫu phân tích. Sử dụng chủng E.coli để gây nhiễm vào mẫu: Mức gây nhiễm xấp sỉ 7*102CFU/g /50 g mẫu, tương đương với 2ml dịch canh khuẩn tại ống pha loãng 10-4. Thực hiện 10 lần với 10 mẫu lặp lại, liên tiếp trong 2 ngày.
Thực hiện thẩm định phương pháp định lượng E.coli theo TCVN 9975: 2013, trên nền mẫu thịt bò và thịt gà, cân 50 g/mẫu với số lần lặp trên mỗi nền mẫu (n=10). Sử dụng chủng chuẩn E,coli gây nhiễm vào 2 nền mẫu với nồng độ gây nhiễm ban đầu có giá trị 1,6* 103 CFU/g tương đương với bổ sung 0,5ml dịch canh khuẩn ở ống có nồng độ 10-3. Xét nghiệm song song 2 phương pháp TCVN 9975: 2013 và TCVN 7924-2: 2008 trong 2 ngày.
Với phương pháp định tính:
Bố trí thí nghiệm trên mỗi nền mẫu như sau (gây nhiễm 3-5 mức, với số vi khuẩn mức thấp nhất gần bằng 0, tăng dần các mức kế tiếp (Thực hiện pha loãng với hệ số pha loãng nhị phân), nồng độ vi khuẩn Salmonella enterica ở các mức như sau:
Mức 1: 1-3cfu/25g/ mẫu: lặp lại 10 lần Mức 2: 3-6cfu/25g/mẫu: lặp lại 10 lần Mức 3: 6-10cfu/25g/mẫu: lặp lại 10 lần Mức 4: 10-20cfu/25g/mẫu: lặp lại 10 lần Mức 5: > 20cfu/25g/mẫu: lặp lại 10 lần
… đến mức n sao cho kết quả đạt được ở mức gây nhiễm nồng độ vi khuẩn thấp nhất đạt được 100% cho kết quả dương tính.
Mẫu âm tính, sử dụng 3 nền mẫu âm tính, mỗi nền mẫu lặp lại 10 lần: mẫu âm trắng, mẫu âm tính sử dụng các chủng vi sinh vật: (Vibrio parahaemolyticus
ATCC®. 17802TM, E.coli ATCC® 11303TM, Staphylococus aureus subsp aureus
Tiến hành phân tích các mẫu đã gây nhiễm theo qui trình của 2 tiêu chuẩn.(Tiêu chuẩn mới sử dụng môi trường Iris Salmonella agar và tiêu chuẩn tham chiếu TCVN 4829:2005).
Các kết quả thu được tính các thông số: giới hạn phát hiện (LOD), độ nhạy (Se), độ đặc hiệu (Sp), độ chính xác (Ac), và hệ số tương đồng kappa (K).
3.4.2. Phương pháp kiểm nghiệm một số chỉ tiêu vi sinh vật trong thịt
Định lượng tổng số VSVHK theo TCVN 9977:2013 Định lượng E.coli theo TCVN 9975: 2013
Phát hiện Salmonella theo TCCS 03:2016/TYV2-CĐ
( Tóm tắt các bước thực hiện từng phương pháp thể hiện ở phụ lục 6)
3.4.3. Phương pháp phân tích số liệu
Các số liệu tính độ lặp lại, độ tái lặp, độ không đảm bảo đo được xử lý thống kê bằng phần mềm Exel.
- Độ lặp lại trên mỗi nền mẫu Sri
1 ) ( 1 2 n x x n i i (với n: số lần lặp lại, xi:
kết quả của lần lặp lại thứ i, x giá trị trung bình)
- Độ lặp lại của phương pháp : Sr Sri2 / n
- Độ tái lặp trên mỗi nền mẫu SR
n b a n i i i 2 ) ( 1 2
(với n: là số mẫu được sử dụng trong đánh giá, ai: Kết quả ngày 1, bi: kết quả ngày 2)
Độ tái lặp của phương pháp : SR SRj2 /n
Độ không đảm bảo đo: (U)
Tương ứng với mỗi mẫu phân tích, độ không đảm bảo đo của mỗi kết quả được tính như sau:
TH1: Độ không đảm bảo đo U=2SR (Nếu kết quả của mẫu C ≥ Clim) TH2: Độ không đảm bảo đo
28 C S
U 2 R2 0,18861 (Nếu kết quả của mẫu C < Clim)
(Trong đó: 2 2 2 2 10 lim 75 , 1 1 05 , 0 1 ) (log R R S S e C , C: tổng số khuẩn lạc trên các đĩa đếm)
Giá trị LOD được tính theo phương pháp của Speaman karber dựa trên kết quả của các nền mẫu gây nhiễm
- Log(LOD50)= L - d(∑Pi – 0.5)= m (1) - LOD50=10m (2) - Um= d2∑(Pi(1- Pi)/(n-1)) (3)
- Với độ tin cậy 95% LOD50 nằm trong khoảng {10m-2SQRT(Um); 10
m+2SQRT(Um)}
Trong đó: - LOD50: Giới hạn phát hiện của phương pháp
- L: Log của số lượng tế bào được gây nhiễm vào thấp nhất mà tại đó 100% phép thử cho kết quả dương tính.
- d: Log của nồng độ pha loãng
- Pi: Tỉ lệ phản ứng dương tính (50% ≤ Pi ≤100%) đối với nồng độ pha loãng thứ i - Um : Ước lượng độ không đảm bảo của m
- n: Số lần lặp lại đối với nồng độ pha loãng thứ i
Độ nhạy của phương pháp (SE), độ đặc hiệu (SP), độ chính xac (AC), chỉ số Kappa (K): được tính dựa vào bảng tương liên
Bảng 1. Bảng tương liên
Mẫu gây nhiễm
Dương tính Âm tính Tổng Phương pháp xét nghiệm Dương tính a b a+b Âm tính c d c+d Tổng a+c b+d N Độ nhạy : Se = a/(a+c) Độ đặc hiệu Sp = d/(b+d)
Kappa K =(P0 –Pe)/ (1-Pe)
Trong đó P0: Tỉ lệ quan sát 2 xét nghiệm đều cho xét nghiệm giống nhau (cả 2 cùng âm hoặc cùng dương)
Pe: Tỉ lệ phù hợp mong muốn P0 = (a+d)/N
Pe+ = (a+b)(a+c)/N Pe- = (c+d)(b+d)/N Pe = (Pe+ +Pe-)/N
Có thể tính Độ nhạy (SE), độ đặc hiệu (SP), độ chính xac (AC), chỉ số Kappa (K): trên phần mềm trực tuyến openepi.
30
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP
4.1.1. Kết quả đánh giá hiệu suất môi trường sử dụng trong thẩm định phương pháp phương pháp
Kết quả đánh giá được thể hiện trong bảng sau:
Bảng 4.1. Kết quả đánh giá hiệu suất môi trường
PP đánh giá Chủng VK MT đánh giá MT tham chiếu Kết quả (CFU/ml) Hiệu suất (PR) NS/ N0 PP kiểm chứng Chuẩn cứ NS N0 TCVN 9977:2013 Escherichia coli E.coli 3M AC PCA 15 0 15 8 0,95 Định lượng PR >0,7 TCVN 9975: 2013 Escherichia coli E.coli 3M EC PCA 15 0 16 0 0, 94 Định lượng PR >0,7 TCCS 03:2016/ TYV2-CĐ Salmonella enteritidis
Iris agar TSA 17
0 19 0 0,89 Định lượng PR>0,5
Căn cứ vào các kết quả thu được trong quá trình đánh giá so sánh với chuẩn cứ trong tiêu chuẩn cho thấy : Với môi trường đặc chọ lọc yêu cầu của TCVN 8128: 2015, hiệu suất phải lớn hơn 0,5; với các môi trường dinh dưỡng đặc yêu cầu hiệu suất môi trường đánh giá phải đạt mức trên 0,7. Kết quả đánh giá hiệu suất các môi trường: Iris Salmonella agar đạt 0,89, hai môi trường đông khô đạt hiệu suất trên 0,9 so với môi trường PCA ( 3M EC đạt 0,94; 3M AC đạt