Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.4. Nội dung nghiên cứu
3.4.1. Đánh giá đặc tính sinh học của chủng giống để sản xuất vắc xin
3.4.1.1. Đánh giá đặc tính sinh học của giống virus Newcastle (LaSota)
a. Đánh giá tính ổn định giống virus ND trên phôi gà
Giống virus Newcastle chủng LaSota được cấy chuyển 5 lần liên tiếp qua trứng có phôi 9-11 ngày tuổi, kiểm tra hiệu giá virus bằng phản ứng HA và EID50 qua từng lần cấy chuyển.
b. Đánh giá độc lực giống virus ND (chủng LaSota)
Để đánh giá độc lực của virus Newcastle, chúng tôi tiến hành kiểm tra các chỉ số sau theo quy định của FAO:
- Chỉ số liều gây nhiễm cho 50% phôi gà EID50;
- Chỉ số gây chết gà khi tiêm vào não gà 1 ngày tuổi ICPI (Intra Cerebral Pathogenicity Index);
- Chỉ số gây chết gà khi tiêm vào tĩnh mạch gà 6 tuần tuổi ICPI (Intra Vein Pathogenicity Index).
3.4.1.2. Đánh giá đặc tính sinh học của giống virus IB-H120
a. Đánh giá tính ổn định giống virus IB-H120 trên phôi gà
Giống virus IB-H120 được cấy chuyển 5 lần liên tiếp trên phôi gà 9-11 ngày tuổi, kiểm tra hiệu giá virus theo phương pháp kiểm tra EID50 qua từng lần cấy chuyển.
b. Đánh giá độc lực giống virus IB-H120
Để xác định chỉ tiêu độc lực của virus IB H120, chúng tôi cũng tiến hành xác định chỉ số EID50. Thí nghiệm được lặp lại liên tiếp 03 lần.
3.4.2. Xác định liều cơ bản của vắc xin đơn giá
3.4.2.1. Chế tạo kháng nguyên
Virus Newcastle, virus IB nhân lên trứng có phôi 9-11 ngày tuổi.Tiến hành thu nước trứng kiểm tra vô trùng và hiệu giá virus HA, EID50 với virus Newcatle và EID50 với virus IB-H120.
3.4.2.2. Nghiên cứu lựa chọn chất bất hoạt
Mỗi loại kháng nguyên được bất hoạt bằng 3 chất bất hoạt: formalin 0,1- 0,3%; BEI 0.1M và beta-probiolacton 0,1%.
Sau quá trình bất hoạt, tiến hành kiểm tra virus bất hoạt trên trứng gà có phôi 9 -11 ngày tuổi. Thí nghiệm được lặp lại 2 lần.
Phối trộn từng loại kháng nguyên bất hoạt với chất bổ trợ dầu (Dầu Montanide ISA 71RVG). Đánh giá đáp ứng miễn dịch từng loại kháng nguyên trên gà mẫn cảm (gà 3 tuần tuổi) dựa vào kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể sau 21 ngày tiêm.
Căn cứ kết quả, lựa chọn được chất bất hoạt phù hợp.
3.4.2.3.Xác định hàm lượng mỗi kháng nguyên có trong 1 liều vắc xin đơn
Với mỗi kháng nguyên, lựa chọn 5 thang liều (cơ số 10) khác nhau. Sử dụng chất bất hoạt được lựa chọn ở trên, phối trộn với chất bổ trợ nhũ dầu theo 5 thang liều. Tiến hành gây miễn dịch cho gà, đánh giá hiệu giá huyết thanh bằng phản ứng HI (kháng nguyên LaSota), phản ứng ELISA (kháng nguyên IB-H120). Căn cứ kết quả đánh giá đáp ứng miễn dịch trên gà mẫn cảm, xác định hàm lượng kháng nguyên có trong một liều vắc xin đơn cho kết quả tối ưu nhất.
3.4.3. Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vắc xin vô hoạt ND-IB
3.4.3.1. Chuẩn bị kháng nguyên bất hoạt
Để có đủ lượng kháng nguyên cho phối trộn vắc xin nhị giá theo các nghiệm thức, bước chuẩn bị kháng nguyên rất quan trọng. Virus Newcastle, virus IB nhân lên trứng có phôi 9-11 ngày tuổi.Tiến hành thu nước trứng kiểm tra vô trùng và hiệu giá virus. Căn cứ kết quả kiểm tra để thực hiện việc chuẩn hóa kháng nguyên.
Đối với virus, có 2 khả năng có thể xảy ra trong quá trình chuẩn bị kháng nguyên. Nếu hiệu giá kháng nguyên đạt cao, đảm bảo đủ hiệu giá để có thể pha loãng trong quá trình nghiên cứu sản xuất, khi đó kháng nguyên chỉ cần xử lý theo quy trình thông thường. Trường hợp kháng nguyên không đạt hiệu giá cần thiết, virus cần phải được cô đặc lại và tinh chế.
Kháng nguyên sau khi đạt hiệu giá virus đạt tiêu chuẩn cho sản xuất sẽ tiến hành bất hoạt virus bằng chất bất hoạt đã lựa chọn. Kiểm tra virus bất hoạt trên trứng gà có phôi 9 -11 ngày tuổi. Thí nghiệm được lặp lại 2 lần để đánh giá quá trình bất hoạt virus.
3.4.3.2. Phối trộn hai kháng nguyên bất hoạt với chất bổ trợ
Trên cơ sở xác định được hàm lượng kháng nguyên có trong một liều vắc xin đơn, xác định sơ bộ vùng nghiệm thức phù hợp. Chín nghiệm thức để phối trộn thành vắc xin được thể hiện ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Nghiệm thức phối trộn vắc xin
Nghiệm thức Newcastle (LaSota) IB (H120)
Nghiệm thức 1 1 1 Nghiệm thức 2 1 2 Nghiệm thức 3 2 1 Nghiệm thức 4 2 2 Nghiệm thức 5 1 3 Nghiệm thức 6 3 1 Nghiệm thức 7 2 3 Nghiệm thức 8 3 2 Nghiệm thức 9 3 3
3.4.3.3. Đánh giá 9 nghiệm thức phối trộn vắc xin và lựa chọn công thức tối ưu nhất
Mỗi nghiệm thức tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu vô trùng, chỉ tiêu hóa lý, đánh giá an toàn và đáp ứng miễn dịch trên gà thí nghiệm;
Phân tích đáp ứng miễn dịch thông qua phản ứng huyết thanh học;
Trên cơ sở các chỉ tiêu được đánh giá, tiến hành lựa chọn nghiệm thức tối ưu nhất.
3.4.4. Sản xuất thử nghiệm
Sản xuất thử nghiệm 03 lô vắc xin vô hoạt nhị giá quy mô phòng thí nghiệm với nghiệm thức được lựa chọn.
3.4.5. Kiểm nghiệm vắc xin
Kiểm nghiệm theo tiêu chuẩn cơ sở ban hành tại công ty gồm: + Kiểm tra các chỉ tiêu hóa lý;
+ Kiểm tra vô trùng; + Kiểm tra an toàn; + Kiểm tra hiệu lực.
3.4.6. Thử nghiệm vắc xin
Thử nghiệm vắc xin trên gà ở quy mô nhỏ (100 con), đánh giá hiệu quả vắc xin thông qua đánh giá hiệu giá kháng thể kháng virus Newcastle (HI) và hiệu giá kháng thể kháng virus IB (ELISA) 21-28 ngày sau tiêm vắc xin.