Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.3. Phương pháp xác định chỉ số độc lực virus Newcastle trên não gà con
-Chuẩn bị dịch niệu nang virus LaSota có hiệu giá HA trên 4log2. Pha loãng virus 1/10 trong PBS vô trùng.
-Gà được theo dõi trong 8 ngày liền, ghi lại những biểu hiện sức khoẻ: ốm, chết, bình thường. Biểu hiện bệnh được tính bằng điểm: Chết (2 điểm); ốm (1 điểm), bình thường (0 điểm).
Bảng 3.3. Xác định chỉ số ICPI
Biểu hiện Ngày theo dõi Cộng
dồn Đơn vị nhân Tổng số điểm 1 2 3 4 5 6 7 8 Bình thường 0 Số con ốm 1 Số con chết 2 A B
Chỉ số ICPI được xác định theo công thức: ICPI = B/A
3.5.4. Phương pháp xác định chỉ số chỉ số độc lực virus Newcastle khi tiêm tĩnh mạch gà 6 tuần tuổi (IVPI - Intravenous Pathogenicity Index)
Chủng virus (nước trứng) được pha với nước sinh lý vô trùng thành huyễn dịch 10-1, tiêm 0,1 ml vào tĩnh mạch cho 10 gà 6 tuần tuổi lấy từ đàn gà sạch bệnh. Kèm theo có lô đối chứng không tiêm dung dịch virus.
Gà được theo dõi trong 10 ngày liền, ghi chép và tính kết quả theo bảng 3.4.
Bảng 3.4. Xác định chỉ số IVPI
Biểu hiện Ngày theo dõi Cộng
dồn Đơn vị nhân Tổng điểm số 1 2 3 4 5…7 8 9 10 Bình thường 0 Số con ốm 1 Số con liệt 2 Số con chết 3 A’ B’
Chỉ số IVPI được xác định theo công thức: IVPI = B’/A’
3.5.5. Phương pháp xác định hiệu giá virus IB-H120 trên trứng gà có phôi
- Đối với giống virus được đông khô, tiến hành hoàn nguyên bằng dung dịch PBS (hoặc nước muối sinh lý 0,9%) vô trùng.
-Dùng dung dịch PBS (hoặc nước muối sinh lý 0,9%) pha loãng virus theo cơ số 10 để có dãy nồng độ từ 10-1 đến 10-10.
-Gây nhiễm virus ở các nồng độ pha loãng vào xoang niệu nang của trứng gà có phôi 9-11 ngày tuổi, mỗi nồng độ 5 quả, mỗi quả 0,1ml. 5 quả không tiêm làm đối chứng.
-Trứng sau gây nhiễm được theo dõi hàng ngày trong 5-7 ngày.
-Những trứng chết phôi trước 24 giờ được loại bỏ.
-Những trứng chết từ sau 24 giờ đến 5-7 ngày được cất tủ lạnh 2 -80C.
-Sau 5-7 ngày toàn bộ trứng sống được giết phôi ở 2-80C qua đêm hoặc ít nhất 4 tiếng trước khi đọc kết quả. Ghi kết quả trứng sống, chết ở các nồng độ.
-Đánh giá sự có mặt virus IB dựa vào bệnh tích đặc trưng trên phôi:
+ Dương tính: Phôi chết sớm hoặc còi cọc (phôi lùn), cơ thể uốn cong hình cầu, một số tích urat ở thận, những phôi chết có hiện tượng xuất huyết toàn thân.
+ Âm tính: Phôi phát triển bình thường so với đối chứng âm
-Ghi kết quả ở các nồng độ pha loãng
-Tính toán liều gây nhiễm 50% (EID50) theo phương pháp Reed- Muench. Tỷ lệ phôi nhiễm (%) = Số lượng nhiễm/ (Tổng số nhiễm + Tổng số không nhiễm) x 100
A - 50
EID50 = x (b – a) + a A – B
A: là tỉ lệ % phôi nhiễm cận trên 50%. B: là tỉ lệ % phôi nhiễm cận dưới 50%.
a: liều gây nhiễm phôi cận trên 50% tính theo độ pha loãng virus. b: liều gây nhiễm phôi cận dưới 50% tính theo độ pha loãng virus.
3.5.6. Phương pháp sản xuất kháng nguyên ND (LaSota) trên phôi trứng gà
Trứng gà Loghorn sạch bệnh được vệ sinh sạch, ấp ở nhiệt độ 37,50C, độ ẩm 65%. Sau 7 ngày ấp, loại bỏ trứng vô tinh và chết phôi. Đến ngày thứ 10, tiếp tục soi thải những trứng bị chết phôi. Đánh dấu buồng hơi và vị trí tiêm.
Giống virus được pha loãng thành nồng độ 10-3 bằng dung dịch PBS vô trùng. Gây nhiễm vào xoang niệu nang, mỗi trứng 0,2ml huyễn dịch giống virus đã pha loãng.
Hàn kín lỗ tiêm, ấp tiếp ở nhiệt độ 370C, độ ẩm 65%. Hằng ngày soi trứng, kiểm tra sự biến đổi của phôi. Những trứng chết trước 24 giờ được loại thải.
Những trứng chết trong thời gian theo dõi được bảo quản ở tủ lạnh 2-80C. Đến 96 giờ sau gây nhiễm, toàn bộ trứng được giết lạnh.
Sau khi giết lạnh 6-8 giờ, tiến hành thu hoạch niệu nang. Ly tâm dịch niệu 4000 vòng/phút trong 30 phút ở 40C. Loại bỏ cặn, thu dịch trong ở phía trên. Thực hiện kiểm tra hiệu giá virus bằng phản ứng HA, EID50.
3.5.7. Phương pháp sản xuất kháng nguyên IB (H120) trên phôi trứng gà
Trứng gà Loghorn sạch bệnh được vệ sinh sạch, ấp ở nhiệt độ 37,50C, độ ẩm 65%. Sau 7 ngày ấp, loại bỏ trứng vô tinh và chết phôi. Đến ngày thứ 10, tiếp tục soi thải những trứng bị chết phôi. Đánh dấu buồng hơi và vị trí tiêm.
Giống virus được pha loãng thành nồng độ 10-2 bằng dung dịch PBS vô trùng. Gây nhiễm vào xoang niệu nang, mỗi trứng 0,2ml huyễn dịch giống virus đã pha loãng.
Hàn kín lỗ tiêm, ấp tiếp ở nhiệt độ 370C, độ ẩm 65%. Hằng ngày soi trứng, kiểm tra sự biến đổi của phôi. Những trứng chết trước 24 giờ được loại thải, sau đó cứ 12 giờ soi trứng 1 lần. Những trứng chết trong thời gian theo dõi được bảo quản ở tủ lạnh 2-80C.
Theo dõi trong 5 ngày, toàn bộ trứng sống và chết phôi đều được giết lạnh qua đêm, tiến hành thu hoạch niệu nang. Ly tâm dịch niệu 4000 vòng/phút trong 30 phút ở 40C. Loại bỏ cặn, thu dịch trong ở phía trên. Thực hiện kiểm tra hiệu giá virus bằng phản ứng EID50 theo phương pháp Reed - Muench.
3.5.8. Phương pháp bất hoạt virus ND, IB và kiểm tra sau bất hoạt
-Cho Formaldehyde 37% vào chai chứa huyễn dịch virus sao cho độ pha loãng cuối cùng của formaldehyde trong huyễn dịch đạt 0,1-0,3% (để đạt nồng độ formaldehyde là 0,1% cần 2,8ml Formaldehyde 37% + 1 lít huyễn dịch). Hàn chai chứa huyễn dịch virus bằng giấy parafiln. Đặt lên máy lắc nằm ngang trong tủ lạnh 40C, qua đêm.
-BEI được sử dụng ở nồng độ 0.1M với thể tích 10% so với thể tích dung dịch. Hỗn dịch virus+ BEI được ủ ấm trong 12giờ.
-β - propiolacton được sử dụng với nồng độ 0.1% trong huyễn dịch, thời gian bất hoạt được thực hiện trong 12giờ ở 4oC.
-Kiểm tra bất hoạt 2 lần liên tiếp trên trứng có phôi 10 ngày tuổi:
+ Ly tâm một lượng nhỏ huyễn dịch virus đã bất hoạt 4000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ 40C thu dịch nổi. Xử lý mẫu virus bằng kháng sinh.
+ Tiêm 10 quả 200µl huyễn dịch virus bất hoạt/quả. Lô đối chứng tiêm 200µl PBS/quả
+ Nuôi 370C trong 5 ngày
+ Theo dõi phôi chết sau gây nhiễm và kiểm tra lại bằng HA (virus ND chủng LaSota); kiểm tra EID50 (virus IB-H120)
- Lặp lại lần 2 như trên
- Nếu sau 2 lần kiểm tra virus đã bất hoạt thì chuyển sang nhũ hóa. Nếu virus chưa bất hoạt thì thực hiện lặp lại các bước nêu trên.
3.5.9. Phương pháp phối trộn kháng nguyên với chất bổ trợ
Quá trình phối trộn kháng nguyên với chất bổ trợ dầu khoáng được thực hiện trên máy tạo nhũ chuyên dụngnhư sau:
- Định lượng lượng dầu khoáng đủ cho một mẻ tạo nhũ vào bình chứa, sử dụng máy tạo nhũ khuấy đều dầu khoáng với tốc độ 4000 vòng/ phút trong thời gian từ 4 - 10 phút.
- Sử dụng bơm vuốt nhu động hoặc máy nén chân không bơm huyễn dịch virus đã vô hoạt vào bình chứa với tôc độ dòng chảy 10 ml/ phút.
- Sau khi đã bơm hết lượng nguyên dịch vào bình chứa, tăng tốc độ máy tạo nhũ lên 6000 vòng/ phút và chạy tiếp 20 - 30 phút.
- Lấy mẫu, kiểm tra pH và sự đồng nhất của nhũ. Nếu kết quả đạt yêu cầu thì kết thúc quá trình tạo nhũ.
3.5.10. Phương pháp kiểm tra chất lượng vắc xin
3.5.10.1. Phương pháp kiểm tra vô trùng
a. Lấy mẫu:
Việc lấy mẫu được áp dụng theo QCVN 01 - 03: 2009/BNNPTNT: “Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về lấy mẫu thuốc thú y để kiểm tra chất lượng”. Lấy mẫu theo lô sản xuất. Đối với vắc xin vô hoạt, quy cách đóng gói cho tới 100ml, số lượng mẫu cần lấy 7-10 mẫu.
b. Kiểm tra vô trùng:
Chỉ tiêu vô trùng được thực hiện theo tiêu chuẩn TCVN 8684:2011. Sử dụng 03 lọ vắc xin/lô sản xuất, đưa vắc xin về nhiệt độ phòng trước khi kiểm tra.
-Chuyển 1ml vắc xin của 03 lọ vắc xin ngẫu nhiên vào ống nghiệm thủy tinh chứa 10ml dung dịch TSB.
-Nuôi tủ ấm 370C trong 3 ngày.
-Huyễn dịch nuôi cấy dùng để cấy chuyển lên các loại môi trường kiểm tra vi khuẩn, nấm mốc và Mycoplasma.
-Cấy huyễn dịch trên vào các môi trường quy định (thạch máu, thạch Marconkey, Thioglycollate, Trypticase Soybean Broth (TSB), thạch Sabouraud), mỗi loại môi trường 2 ống. Các môi trường nêu trên được chế theo quy định thông dụng để phát hiện vi khuẩn hiếu khí, yếm khí, salmonella và vi khuẩn gây dung huyết có trong vắc xin.
-Lượng vắc xin cấy kiểm tra bằng 1-2% dung tích môi trường
-Môi trường đã cấy kiểm tra được để tủ ấm 370C theo dõi hàng ngày trong 7 ngày. Riêng môi trường kiểm tra nấm (thạch Sabouraud) để ở nhiệt độ 250C, theo dõi hàng ngày trong 14 ngày.
-Để kiểm tra tạp nhiễm Mycoplasma, mẫu vắc xin được cấy kiểm tra trên môi trường nước PPLO (100µl vắc xin trong 10ml môi trường) và đĩa thạch PPLO có bổ sung huyết thanh ngựa và chất chiết nấm men với thể tích 0,1 ml vắc xin trên 1 đĩa (Có thể sử dụng dung dịch DPN-cystein, được bổ sung nicotinamid adenin dinucleotid, L-cystein hydroclorua và huyết thanh ngựa hoặc sử dụng môi trường canh thang tim được bổ sung proteoza pepton và chất chiết nấm men để làm môi trường kiểm tra). Theo dõi 14 ngày ở nhiệt độ 33-370C đối với môi trường dung dịch PPLO. Tại các ngày 3, 7, 10 và ngày 14 lấy canh khuẩn ở môi trường nước ria cấy trên môi trường thạch PPLO (2 đĩa). Để ở 370C trong tủ CO2 (4-6%) theo dõi trong 28 ngày.
-Mẫu được xem là đạt tiêu chuẩn khi không có bất cứ vi sinh vật nào mọc trên môi trường kiểm tra trong thời gian theo dõi.
3.5.10.2. Phương pháp kiểm tra hóa lý vắc xin
a. Kiểm tra cảm quan
Đặt lọ vaccine trước của một nền trắng (giấy trắng), bằng mắt thường xác định màu sắc của lọ vaccine trong điều kiện ánh sáng ban ngày. Quan sát trạng thái, màu sắc của mẫu vắc xin.
Mẫu vắc xin đạt tiêu chuẩn có màu trắng ngà, hỗn dịch đồng nhất, không bị phân lớp, không đông vón, không lắng cặn, không có dị vật bất thường.
b. Kiểm tra độ nhớt
-Phương pháp 1: Chuyển vắc xin vào ốc đong nhúng ngập điện cực của máy đo vào cốc vắc xin. Vận hành máy và ghi lại giá trị hiển thị.
-Phương pháp 2: Sử dụng pippet 1ml, có đường kính trên là 2,7mm và dưới là 1,2 mm, hút 1 ml vắc xin và cho chảy xuống tự nhiên theo chiều thẳng đứng, ghi nhận kết quả chảy của 0,4 ml. Nếu dưới 8 giây thì vắc xin n đạt yêu cầu.
c. Kiểm tra độ ổn định
Thực hiện 1 trong ba phương pháp sau:
-Phương pháp 1: Phương pháp Drop test (theo quy trình của hãng SEPPIC): Dùng cốc đong có thể tích 250 ml chứa 200ml nước cất. Nhỏ 1 giọt vắc xin (≈ 3 mg) lên bề mặt nước (chú ý không khuấy). Nếu giọt vắc xin lan nhanh, nổi trên bề mặt nước kể cả khi lắc nhẹ cốc đong thì vắc xin đạt yêu cầu là vắc xin nước trong dầu (water in oil).
-Phương pháp 2: Chuyển mẫu vắc xin vô hoạt nhũ dầu vào ống ly tâm, đem ly tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút. Nếu phần nước tách ra ở ở ống ly tâm <0.5ml thì vắc xin được xem là ổn định.
-Phương pháp 3: Kiểm tra độổn định của vắc xin (theo qui trình của hãng SEPPIC): Chia vắc xin vào 2 chai nhựa loại 20 ml rồi đậy chặt nắp, 1 chai bảo quản ở 2- 80C và 1 chai bảo quản ở nhiệt độ phòng (từ 20-250C). Theo dõi sự thay đổi của vắc xin sau 2 tuần, 1 tháng, 6 tháng, 1 năm.
-Vắc xin được coi là đạt tính ổn định khi vắc xin phải trắng và đồng nhất từ trên xuống đáy hoặc có thể có một lớp dầu (<10% thể tích) trên bề mặt hoặc có thể tầng đáy có màu trắng hơn nhưng khi lắc đều lại trở nên đồng nhất là được. Vắc xin phải giữ được độ ổn định sau 2 năm ở điều kiện bảo quản 2 - 80C và khoảng 1 tháng ở nhiệt độ phòng.
3.5.10.3. Phương pháp kiểm tra vô hoạt vắc xin
- Tiêm ít nhất 100 trứng gà có phôi 9-11 ngày tuổi, mỗi trứng 0,2 ml vắc xin vào xoang niệu mô. Ấp các trứng đã được tiêm ở tủ ấm 370C trong 5 ngày. Mổ thu hoạch nước trứng làm phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA) và kiểm tra bệnh tích phôi (IB).
- Vắc xin được coi là vô hoạt khi phôi không có bệnh tích đặc trưng của virus IB và nước trứng cho kết quả âm tính trong phản ứng ngưng kết hồng cầu với kháng nguyên virus Newcastle.
3.5.10.4. Phương pháp kiểm tra an toàn
- Sử dụng ít nhất 10 gà 21-28 ngày tuổi từ đàn gà sạch bệnh, chưa sử dụng vắc xin Newcastle và vắc xin IB. Mỗi gà được sử dụng 2 liều vắc xin theo đường tiêm bắp. Quan sát gà trong 21 ngày.
- Nếu trong quá trình quan sát, nhiều hơn 2 gà bị chết với nguyên nhân không phải đặc trưng của bệnh Newcastle và bệnh IB, thì tiến hành kiểm tra nhắc lại.
- Vắc xin được coi là an toàn nếu tất cả gà sống khỏe mạnh, phát triển bình thường và không có biến đổi bất thường về cục bộ hay triệu chứng toàn thân.
3.5.10.5. Phương pháp kiểm tra hiệu lực
- Sử dụng 40 gà 21-28 ngày tuổi từ đàn gà sạch bệnh chia làm 2 nhóm:
+ Nhóm 1: gồm 20 con, mỗi con được tiêm 1 liều vắc xin ghi trên nhãn, theo đường tiêm bắp;
+ Nhóm 2: gồm 10 con làm đối chứng, không tiêm vắc xin.
- Sau khi tiêm 21 ngày, tất cả gà nhóm 1 và nhóm 2 được lấy máu, thu huyết thanh làm phản ứng HI để kiểm tra kháng thể Newcastle, thực hiện phản ứng ELISA để kiểm tra kháng thể kháng virus IB.
- Vắc xin đạt tiêu chuẩn nếu:
Hiệu giá HI (Newcastle) đạt 4log2 (1:16) trở lên, có ít nhất 80% mẫu dương tính với Elisa -IB đối với gà nhóm 1 (gà miễn dịch) và có ít nhất 80% mẫu âm tính với Elisa - IB, hiệu giá HI (Newcastle) ≤ 2log2 (1:4) đối với gà nhóm 2 (gà đối chứng).
3.5.11. Phương pháp xác định hiệu giá kháng thể kháng virus ND trong huyết thanh gà sau khi sử dụng vắc xin bằng phản ứng ngăn trở ngưng kết huyết thanh gà sau khi sử dụng vắc xin bằng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà HI (haemagglutination inhibition)
-Dùng đĩa nhựa 96 giếng, đáy chữ V hoặc U;
-Cho 50 µl nước muối sinh lý NaCl 0.9/5/PBS vào mỗi giếng từ giếng 1 đến giếng 12;
-Cho 50 µl huyết thanh cần kiểm tra vào giếng 1;
- Pha loãng huyết thanh theo cơ số 2: Trộn đều huyết thanh ở giếng 1, rồi hút 50 µl chuyển sang giếng 2 trộn đều, hút 50 µl chuyển sang giếng 3 tiếp tục làm như vậy đến giếng 11, hút bỏ 50 µl đi ở giếng 11;
-Cho kháng nguyên 4 đơn vị HA vào các giếng từ số 1 đến số 11, mỗi giếng 50 µl;
-Giếng 12 cho thêm 50 µl PBS;
-Lắc nhẹ, để nhiệt độ phòng 30 phút đến 1 giờ; -Cho vào mỗi giếng 50 µl hồng cầu 0.5-1%, lắc nhẹ;
-Để đĩa phản ứng ở nhiệt độ phòng. Sau 25-30 phút đọc kết quả.
Bảng 3.5. Sơ đồ thực hiện phản ứng HI (haemagglutination inhibition)
Nguyên liệu Giếng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 (đối chứng) NaCl 0.9%/PBS (µl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
Huyết thanh 50 Trộn đều, chuyển 50 từ giếng 1 đến 11 rồi hút bỏ 50 µl 0 KN 4 HA (µl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 0