Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.2. Thời gian nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 9/2019 đến tháng 6/2020.
3.3. ĐỐI TƯỢNG/VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
3.3.1. Đối tượngnghiên cứu
- Giống virus Newcastle (chủng LaSota), virus viêm phế quản truyền nhiễm (chủng H120) đang được lưu trữ tại Công ty Cổ phần Thuốc thú y Trung Ương 5.
3.3.2. Vật liệunghiên cứu
3.3.2.1. Động vật thí nghiệm
- Gà khỏe mạnh, có huyết thanh âm tính với virus Newcastle và virus viêm phế quản truyền nhiễm, gà 1 ngày tuổi cho thí nghiệm ICPI, gà 4-6 tuần cho thí nghiệm hiệu lực vắc xin, IVPI;
- Gà trống khỏe mạnh lấy máu làm hồng cầu gà 1%;
- Trứng gà có phôi 10 ngày được thu từ những gà chưa sử dụng vắc xin phòng bệnh Newcastle, bệnh Viêm phế quản truyền nhiễm.
3.3.2.2. Hóa chất nguyên vật liệu
- Kít ELISA Idexx phát hiện kháng thể kháng virus IB;
- Formalin, BEI, beta-probiolacton; NaCl, PBS, Natricitrat, Keo phèn, Montanide Isa 71, TSB, Marconkey, Thioglycolate, thạch nấm, thạch máu;
- Ống Eppendorf, ông li tâm 15ml, 50ml, các loại đầu tip 2-1000µl, kim tiêm, seringe. Ngoài ra còn có các dụng cụ thông thường phục vụ trong sản xuất vắc xin.
3.3.2.3. Máy móc thiết bị
- Pipette các loại, máy li tâm lạnh, máy ly tâm thường, máy vortex, tủ ấm, máy ấp trứng, máy tạo nhũ, tủ lạnh 2-80C, tủ lạnh -300C, -800C.
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.4.1. Đánh giá đặc tính sinh học của chủng giống để sản xuất vắc xin
3.4.1.1. Đánh giá đặc tính sinh học của giống virus Newcastle (LaSota)
a. Đánh giá tính ổn định giống virus ND trên phôi gà
Giống virus Newcastle chủng LaSota được cấy chuyển 5 lần liên tiếp qua trứng có phôi 9-11 ngày tuổi, kiểm tra hiệu giá virus bằng phản ứng HA và EID50 qua từng lần cấy chuyển.
b. Đánh giá độc lực giống virus ND (chủng LaSota)
Để đánh giá độc lực của virus Newcastle, chúng tôi tiến hành kiểm tra các chỉ số sau theo quy định của FAO:
- Chỉ số liều gây nhiễm cho 50% phôi gà EID50;
- Chỉ số gây chết gà khi tiêm vào não gà 1 ngày tuổi ICPI (Intra Cerebral Pathogenicity Index);
- Chỉ số gây chết gà khi tiêm vào tĩnh mạch gà 6 tuần tuổi ICPI (Intra Vein Pathogenicity Index).
3.4.1.2. Đánh giá đặc tính sinh học của giống virus IB-H120
a. Đánh giá tính ổn định giống virus IB-H120 trên phôi gà
Giống virus IB-H120 được cấy chuyển 5 lần liên tiếp trên phôi gà 9-11 ngày tuổi, kiểm tra hiệu giá virus theo phương pháp kiểm tra EID50 qua từng lần cấy chuyển.
b. Đánh giá độc lực giống virus IB-H120
Để xác định chỉ tiêu độc lực của virus IB H120, chúng tôi cũng tiến hành xác định chỉ số EID50. Thí nghiệm được lặp lại liên tiếp 03 lần.
3.4.2. Xác định liều cơ bản của vắc xin đơn giá
3.4.2.1. Chế tạo kháng nguyên
Virus Newcastle, virus IB nhân lên trứng có phôi 9-11 ngày tuổi.Tiến hành thu nước trứng kiểm tra vô trùng và hiệu giá virus HA, EID50 với virus Newcatle và EID50 với virus IB-H120.
3.4.2.2. Nghiên cứu lựa chọn chất bất hoạt
Mỗi loại kháng nguyên được bất hoạt bằng 3 chất bất hoạt: formalin 0,1- 0,3%; BEI 0.1M và beta-probiolacton 0,1%.
Sau quá trình bất hoạt, tiến hành kiểm tra virus bất hoạt trên trứng gà có phôi 9 -11 ngày tuổi. Thí nghiệm được lặp lại 2 lần.
Phối trộn từng loại kháng nguyên bất hoạt với chất bổ trợ dầu (Dầu Montanide ISA 71RVG). Đánh giá đáp ứng miễn dịch từng loại kháng nguyên trên gà mẫn cảm (gà 3 tuần tuổi) dựa vào kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể sau 21 ngày tiêm.
Căn cứ kết quả, lựa chọn được chất bất hoạt phù hợp.
3.4.2.3.Xác định hàm lượng mỗi kháng nguyên có trong 1 liều vắc xin đơn
Với mỗi kháng nguyên, lựa chọn 5 thang liều (cơ số 10) khác nhau. Sử dụng chất bất hoạt được lựa chọn ở trên, phối trộn với chất bổ trợ nhũ dầu theo 5 thang liều. Tiến hành gây miễn dịch cho gà, đánh giá hiệu giá huyết thanh bằng phản ứng HI (kháng nguyên LaSota), phản ứng ELISA (kháng nguyên IB-H120). Căn cứ kết quả đánh giá đáp ứng miễn dịch trên gà mẫn cảm, xác định hàm lượng kháng nguyên có trong một liều vắc xin đơn cho kết quả tối ưu nhất.
3.4.3. Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vắc xin vô hoạt ND-IB
3.4.3.1. Chuẩn bị kháng nguyên bất hoạt
Để có đủ lượng kháng nguyên cho phối trộn vắc xin nhị giá theo các nghiệm thức, bước chuẩn bị kháng nguyên rất quan trọng. Virus Newcastle, virus IB nhân lên trứng có phôi 9-11 ngày tuổi.Tiến hành thu nước trứng kiểm tra vô trùng và hiệu giá virus. Căn cứ kết quả kiểm tra để thực hiện việc chuẩn hóa kháng nguyên.
Đối với virus, có 2 khả năng có thể xảy ra trong quá trình chuẩn bị kháng nguyên. Nếu hiệu giá kháng nguyên đạt cao, đảm bảo đủ hiệu giá để có thể pha loãng trong quá trình nghiên cứu sản xuất, khi đó kháng nguyên chỉ cần xử lý theo quy trình thông thường. Trường hợp kháng nguyên không đạt hiệu giá cần thiết, virus cần phải được cô đặc lại và tinh chế.
Kháng nguyên sau khi đạt hiệu giá virus đạt tiêu chuẩn cho sản xuất sẽ tiến hành bất hoạt virus bằng chất bất hoạt đã lựa chọn. Kiểm tra virus bất hoạt trên trứng gà có phôi 9 -11 ngày tuổi. Thí nghiệm được lặp lại 2 lần để đánh giá quá trình bất hoạt virus.
3.4.3.2. Phối trộn hai kháng nguyên bất hoạt với chất bổ trợ
Trên cơ sở xác định được hàm lượng kháng nguyên có trong một liều vắc xin đơn, xác định sơ bộ vùng nghiệm thức phù hợp. Chín nghiệm thức để phối trộn thành vắc xin được thể hiện ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Nghiệm thức phối trộn vắc xin
Nghiệm thức Newcastle (LaSota) IB (H120)
Nghiệm thức 1 1 1 Nghiệm thức 2 1 2 Nghiệm thức 3 2 1 Nghiệm thức 4 2 2 Nghiệm thức 5 1 3 Nghiệm thức 6 3 1 Nghiệm thức 7 2 3 Nghiệm thức 8 3 2 Nghiệm thức 9 3 3
3.4.3.3. Đánh giá 9 nghiệm thức phối trộn vắc xin và lựa chọn công thức tối ưu nhất
Mỗi nghiệm thức tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu vô trùng, chỉ tiêu hóa lý, đánh giá an toàn và đáp ứng miễn dịch trên gà thí nghiệm;
Phân tích đáp ứng miễn dịch thông qua phản ứng huyết thanh học;
Trên cơ sở các chỉ tiêu được đánh giá, tiến hành lựa chọn nghiệm thức tối ưu nhất.
3.4.4. Sản xuất thử nghiệm
Sản xuất thử nghiệm 03 lô vắc xin vô hoạt nhị giá quy mô phòng thí nghiệm với nghiệm thức được lựa chọn.
3.4.5. Kiểm nghiệm vắc xin
Kiểm nghiệm theo tiêu chuẩn cơ sở ban hành tại công ty gồm: + Kiểm tra các chỉ tiêu hóa lý;
+ Kiểm tra vô trùng; + Kiểm tra an toàn; + Kiểm tra hiệu lực.
3.4.6. Thử nghiệm vắc xin
Thử nghiệm vắc xin trên gà ở quy mô nhỏ (100 con), đánh giá hiệu quả vắc xin thông qua đánh giá hiệu giá kháng thể kháng virus Newcastle (HI) và hiệu giá kháng thể kháng virus IB (ELISA) 21-28 ngày sau tiêm vắc xin.
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1. Phương pháp xác định hiệu giá virus ND (LaSota) bằng phản ứng HA
(Haemagglutination)
-Dùng đĩa nhựa 96 giếng, đáy chữ V hoặc U;
-Nhỏ 50µl/giếng dung dịch PBS 1X hoặc NaCl 0.9% từ giếng 1 đến giếng 12;
-Nhỏ 50 µl mẫu cần kiểm tra vào giếng 1;
-Pha loãng theo cơ số 2: Trộn đều ở giếng 1, hút 50µl chuyển sang giếng 2 và trộn đều, hút 50µl từ giếng 2 chuyển sang giếng 3 và trộn đều, tiếp tục làm như vậy đến giếng 11, hút bỏ 50µl. Giếng 12 là đối chứng hồng cầu;
-Bổ sung hồng cầu: 50µl/giếng hồng cầu gà 1% vào tất cả các giếng. Lắc nhẹ. Để đĩa phản ứng ở nhiệt độ phòng, đọc kết quả sau 25-30 phút;
-Đọc kết quả.
+ Phản ứng dương tính: Có hạt ngưng kết lấm chấm;
+ Phản ứng âm tính: Hồng cầu lắng xuống đáy tạo thành chấm tròn;
+ Hiệu giá ngưng kết được tính ở độ pha loãng kháng nguyên cao nhất còn xuất hiện ngưng kết hoàn toàn. Hiệu giá ngưng kết này được tính là 1 đơn vị HA= 1HAU.
- Sơ đồ thực hiện được thể hiện ở Bảng 3.2.
Bảng 3.2. Sơ đồ thực hiện phản ứng HACác Các bước Giếng N.liệu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Pha loãng KN PBS/NaCl 0.9% (µl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 Kháng nguyên (µl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 0 Cho hồng cầu Hồng cầu (µl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 Độ pha loãng KN 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ─ ─ − − − − − − − − − 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024 2048
3.5.2. Phương pháp xác định hiệu giá virus ND (LaSota) trên trứng gà có phôi (EID50) phôi (EID50)
Giống sản xuất, dịch virus được chuẩn độ trên trứng gà có phôi 9-11 ngày tuổi và được tính toán theo phương pháp Reed – Muench. (Reed & Muench, 1938)
-Dùng dung dịch PBS (hoặc nước muối sinh lý 0,9%) pha loãng virus theo cơ số 10 để có dãy nồng độ từ 10-1 đến 10-10.
-Gây nhiễm virus ở các nồng độ pha loãng vào xoang niệu nang của trứng gà có phôi 9-11 ngày tuổi, mỗi nồng độ 5 quả, mỗi quả 0,1ml. 5 quả không tiêm làm đối chứng.
-Trứng sau gây nhiễm được theo dõi hàng ngày trong 5 ngày.
-Những trứng chết phôi trước 24 giờ được thải bỏ.
-Những trứng chết từ sau 24 giờ đến 5 ngày được cất tủ lạnh 2 -80C.
-Sau 5 ngày toàn bộ trứng sống được giết phôi ở 2-80C qua đêm hoặc ít nhất 4 tiếng trước khi đọc kết quả.
-Trứng sau khi được giết lạnh, tiến hành mổ trứng, thu dịch niệu nang. Đánh giá sự có mặt virus Newcastle bằng phản ứng HA
-Ghi kết quả ở các nồng độ pha loãng
-Tính toán liều gây nhiễm 50% (EID50) theo phương pháp Reed- Muench. Tỷ lệ phôi nhiễm (%) = Tổng nhiễm/ (Tổng số nhiễm + Tổng số không nhiễm) x 100
A - 50
EID50 = x (b – a) + a A – B
A: là tỉ lệ % phôi nhiễm cận trên 50%. B: là tỉ lệ % phôi nhiễm cận dưới 50%.
a: liều gây nhiễm phôi cận trên 50% tính theo độ pha loãng virus. b: liều gây nhiễm phôi cận dưới 50% tính theo độ pha loãng virus.
3.5.3. Phương pháp xác định chỉ số độc lực virus Newcastle trên não gà con 01 ngày tuổi (ICPI - Intracerebral Pathogenicity Index) 01 ngày tuổi (ICPI - Intracerebral Pathogenicity Index)
-Chuẩn bị dịch niệu nang virus LaSota có hiệu giá HA trên 4log2. Pha loãng virus 1/10 trong PBS vô trùng.
-Gà được theo dõi trong 8 ngày liền, ghi lại những biểu hiện sức khoẻ: ốm, chết, bình thường. Biểu hiện bệnh được tính bằng điểm: Chết (2 điểm); ốm (1 điểm), bình thường (0 điểm).
Bảng 3.3. Xác định chỉ số ICPI
Biểu hiện Ngày theo dõi Cộng
dồn Đơn vị nhân Tổng số điểm 1 2 3 4 5 6 7 8 Bình thường 0 Số con ốm 1 Số con chết 2 A B
Chỉ số ICPI được xác định theo công thức: ICPI = B/A
3.5.4. Phương pháp xác định chỉ số chỉ số độc lực virus Newcastle khi tiêm tĩnh mạch gà 6 tuần tuổi (IVPI - Intravenous Pathogenicity Index)
Chủng virus (nước trứng) được pha với nước sinh lý vô trùng thành huyễn dịch 10-1, tiêm 0,1 ml vào tĩnh mạch cho 10 gà 6 tuần tuổi lấy từ đàn gà sạch bệnh. Kèm theo có lô đối chứng không tiêm dung dịch virus.
Gà được theo dõi trong 10 ngày liền, ghi chép và tính kết quả theo bảng 3.4.
Bảng 3.4. Xác định chỉ số IVPI
Biểu hiện Ngày theo dõi Cộng
dồn Đơn vị nhân Tổng điểm số 1 2 3 4 5…7 8 9 10 Bình thường 0 Số con ốm 1 Số con liệt 2 Số con chết 3 A’ B’
Chỉ số IVPI được xác định theo công thức: IVPI = B’/A’
3.5.5. Phương pháp xác định hiệu giá virus IB-H120 trên trứng gà có phôi
- Đối với giống virus được đông khô, tiến hành hoàn nguyên bằng dung dịch PBS (hoặc nước muối sinh lý 0,9%) vô trùng.
-Dùng dung dịch PBS (hoặc nước muối sinh lý 0,9%) pha loãng virus theo cơ số 10 để có dãy nồng độ từ 10-1 đến 10-10.
-Gây nhiễm virus ở các nồng độ pha loãng vào xoang niệu nang của trứng gà có phôi 9-11 ngày tuổi, mỗi nồng độ 5 quả, mỗi quả 0,1ml. 5 quả không tiêm làm đối chứng.
-Trứng sau gây nhiễm được theo dõi hàng ngày trong 5-7 ngày.
-Những trứng chết phôi trước 24 giờ được loại bỏ.
-Những trứng chết từ sau 24 giờ đến 5-7 ngày được cất tủ lạnh 2 -80C.
-Sau 5-7 ngày toàn bộ trứng sống được giết phôi ở 2-80C qua đêm hoặc ít nhất 4 tiếng trước khi đọc kết quả. Ghi kết quả trứng sống, chết ở các nồng độ.
-Đánh giá sự có mặt virus IB dựa vào bệnh tích đặc trưng trên phôi:
+ Dương tính: Phôi chết sớm hoặc còi cọc (phôi lùn), cơ thể uốn cong hình cầu, một số tích urat ở thận, những phôi chết có hiện tượng xuất huyết toàn thân.
+ Âm tính: Phôi phát triển bình thường so với đối chứng âm
-Ghi kết quả ở các nồng độ pha loãng
-Tính toán liều gây nhiễm 50% (EID50) theo phương pháp Reed- Muench. Tỷ lệ phôi nhiễm (%) = Số lượng nhiễm/ (Tổng số nhiễm + Tổng số không nhiễm) x 100
A - 50
EID50 = x (b – a) + a A – B
A: là tỉ lệ % phôi nhiễm cận trên 50%. B: là tỉ lệ % phôi nhiễm cận dưới 50%.
a: liều gây nhiễm phôi cận trên 50% tính theo độ pha loãng virus. b: liều gây nhiễm phôi cận dưới 50% tính theo độ pha loãng virus.
3.5.6. Phương pháp sản xuất kháng nguyên ND (LaSota) trên phôi trứng gà
Trứng gà Loghorn sạch bệnh được vệ sinh sạch, ấp ở nhiệt độ 37,50C, độ ẩm 65%. Sau 7 ngày ấp, loại bỏ trứng vô tinh và chết phôi. Đến ngày thứ 10, tiếp tục soi thải những trứng bị chết phôi. Đánh dấu buồng hơi và vị trí tiêm.
Giống virus được pha loãng thành nồng độ 10-3 bằng dung dịch PBS vô trùng. Gây nhiễm vào xoang niệu nang, mỗi trứng 0,2ml huyễn dịch giống virus đã pha loãng.
Hàn kín lỗ tiêm, ấp tiếp ở nhiệt độ 370C, độ ẩm 65%. Hằng ngày soi trứng, kiểm tra sự biến đổi của phôi. Những trứng chết trước 24 giờ được loại thải.
Những trứng chết trong thời gian theo dõi được bảo quản ở tủ lạnh 2-80C. Đến 96 giờ sau gây nhiễm, toàn bộ trứng được giết lạnh.
Sau khi giết lạnh 6-8 giờ, tiến hành thu hoạch niệu nang. Ly tâm dịch niệu 4000 vòng/phút trong 30 phút ở 40C. Loại bỏ cặn, thu dịch trong ở phía trên. Thực hiện kiểm tra hiệu giá virus bằng phản ứng HA, EID50.
3.5.7. Phương pháp sản xuất kháng nguyên IB (H120) trên phôi trứng gà
Trứng gà Loghorn sạch bệnh được vệ sinh sạch, ấp ở nhiệt độ 37,50C, độ ẩm 65%. Sau 7 ngày ấp, loại bỏ trứng vô tinh và chết phôi. Đến ngày thứ 10, tiếp tục soi thải những trứng bị chết phôi. Đánh dấu buồng hơi và vị trí tiêm.
Giống virus được pha loãng thành nồng độ 10-2 bằng dung dịch PBS vô trùng. Gây nhiễm vào xoang niệu nang, mỗi trứng 0,2ml huyễn dịch giống virus đã pha loãng.
Hàn kín lỗ tiêm, ấp tiếp ở nhiệt độ 370C, độ ẩm 65%. Hằng ngày soi trứng, kiểm tra sự biến đổi của phôi. Những trứng chết trước 24 giờ được loại thải, sau đó cứ 12 giờ soi trứng 1 lần. Những trứng chết trong thời gian theo dõi được bảo quản ở tủ lạnh 2-80C.
Theo dõi trong 5 ngày, toàn bộ trứng sống và chết phôi đều được giết lạnh qua đêm, tiến hành thu hoạch niệu nang. Ly tâm dịch niệu 4000 vòng/phút trong 30 phút ở 40C. Loại bỏ cặn, thu dịch trong ở phía trên. Thực hiện kiểm tra hiệu giá virus bằng phản ứng EID50 theo phương pháp Reed - Muench.
3.5.8. Phương pháp bất hoạt virus ND, IB và kiểm tra sau bất hoạt
-Cho Formaldehyde 37% vào chai chứa huyễn dịch virus sao cho độ pha loãng cuối cùng của formaldehyde trong huyễn dịch đạt 0,1-0,3% (để đạt nồng độ formaldehyde là 0,1% cần 2,8ml Formaldehyde 37% + 1 lít huyễn dịch). Hàn chai chứa huyễn dịch virus bằng giấy parafiln. Đặt lên máy lắc nằm ngang trong