Đời virus (P) Hiệu giá virus EID50/1ml
P1 5,84
P2 6,50
P3 6,70
P4 6,90
P5 6,90
Qua bảng 4.7, cho thấy hiệu giá virus tương đối ổn định. Từ lần tiêm truyền thứ 2 trở đi hiệu giá virus ổn định từ 106,5 – 106,9 EID50/1ml.
4.1.2.2. Kết quả đánh giá độc lực giống virus IB-H120
Để xác định chỉ tiêu độc lực của virus IB H120, tiến hành xác định chỉ số EID50 trên phôi trứng gà 9 – 11 ngày tuổi. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Kết quả xác định chỉ số độc lực EID50 của virus IB-H120 dựa vào quan sát bệnh tích phôi. Những phôi bị nhiễm IB (dương tính) là những phôi chậm phát triển, còi cọc, cơ thể uốn cong hình cầu, hai chân ép lên đầu cùng với chứng suy nhược các bắp cơ (gọi là phôi lùn) và lắng đọng urat trong thận, nước xoang niệu mô trong, một số phôi sớm có biểu hiện xuất huyết toàn thân. Kết quả được trình bày ở bảng 4.8.
Kết quả cho thấy độ pha loãng virus càng thấp, số phôi nhiễm càng giảm, số phôi không nhiễm càng tăng. Độ pha loãng virus từ 10-1 đến 10-4, toàn bộ phôi đều bị nhiễm. Ở độ pha loãng 10-5, tỷ lệ phôi nhiễm là 85,71%. Tiếp theo ở độ pha loãng thấp hơn là 10-6 thì chỉ có 33,33% số phôi nhiễm và tỷ lệ phôi nhiễm từ độ pha loãng 10-7 đến 10-10, không có phôi nhiễm. Kết quả xác định độc lực virus IB-H120 bằng chỉ số EID50 được tính toán theo công thức Reed – Muench có giá trị bằng 10-5,68/0,1 ml, có nghĩa là với nồng độ pha loãng virus 10-5,68 khi nhiễm vào trứng gà có phôi thì có khả năng gây nhiễm 50% số trứng thí nghiệm, do đó hiệu giá virus đạt được là 105,68EID50/0,1 ml (tức 106,68EID50/1 ml).
Bảng 4.8. Kết quả EID50 giống IB- H120 lần 1 Độ pha loãng virus Liều gây nhiễm (ml) Số trứng thí nghiệm Số thực tế Số tính toán Tỷ lệ nhiễm (%) Số trứng có bệnh tích phôi (I) Số trứng không có bệnh tích phôi (N) (i) (n) i i + n 10-1 0,1 05 05 0 26 0 26/26 100 10-2 0,1 05 05 0 21 0 21/21 100 10-3 0,1 05 05 0 16 0 16/16 100 10-4 0,1 05 05 0 11 0 11/11 100 10-5 0,1 05 04 01 6 1 6/7 85,71 10-6 0,1 05 02 03 2 4 2/6 33,33 10-7 0,1 05 0 05 0 9 0/9 0 10-8 0,1 05 0 05 0 14 0/14 0 10-9 0,1 05 0 05 0 19 0/19 0 10-10 0,1 05 0 05 0 24 0/24 0 Ghi chú: - I: Số trứngcó bệnh tích phôi ở mỗi nồng độ
- N: Số trứng không có bệnh tích phôi ở mỗi nồng độ
- i: số trứng có bệnh tích phôi (cộng dồn từ dưới lên)
- n: số trứng không có bệnh tích phôi (cộng dồn từ trên xuống)
Thí nghiệm lần 2 cũng được tiến hành tương tự như lần 1, chỉ số EID50 ở lần 2 và lần 3 lần lượt có giá trị 106,84EID50/1ml và 106,9EID50/1ml. Trung bình qua 3 lần thí nghiệm, chỉ số độc lực của virus IB-H120 là 106,8EID50/1ml.
Sau khi chuẩn độ cho thấy giống virus IB-H120 thích nghi trên trứng gà có phôi đã có đặc tính gây nhiễm ở nồng độ phù hợp với lý lịch giống ban đầu.
4.2. KẾTQUẢ XÁC ĐỊNHLIỀUCƠBẢNVẮC XIN ĐƠN GIÁ
4.2.1. Kết quả sản xuất kháng nguyên ND (LaSota) và IB-H120
Virus Newcastle và virus IB-H120 là những virus thích nghi trên phôi trứng gà 9-11 ngày tuổi. Việc sản xuất kháng nguyên trên phôi trứng thu được một lượng lớn kháng nguyên, giúp tiết kiệm thời gian và chi phí sản xuất. Kết quả sản xuất kháng nguyên được trình bày ở bảng 4.9.
Bảng 4.9. Kết quả sản xuất kháng nguyên LaSota và IB-H120 Tên Tên Kháng nguyên Tên giống virus Hệ số pha giống Liều gây nhiễm (ml) Thời gian theo dõi
Hiệu giá VR Vô
trùng
ND-
LaSota LaSota 10
-3 0,2ml/quả 96 giờ HA=10log2,
109,7 EID50/1ml Đạt IB-
H120 IB-H120 10
-2 0,2ml/quả 120 giờ 106,9 EID50/1ml Đạt
Qua bảng 4.9 cho thấy, sau thời gian gây nhiễm 96 giờ, ở nồng độ gây nhiễm 10-3, hiệu giá virus của kháng nguyên LaSota thu được có hiệu giá HA đạt 10 log2 và 109,7EID50/1ml. Sau thời gian gây nhiễm 120 giờ, ở nồng độ gây nhiễm 10-2, hiệu giá virus của kháng nguyên IB-H120 thu được có hiệu giá 106,9EID50/1ml.
4.2.2. Kết quả lựa chọn chất bất hoạt virus
Để lựa chọn được chất bất hoạt phù hợp, chúng tôi tiến hành bất hoạt bằng 3 chất bất hoạt khác nhau: Formalin, BEI và β- probiolacton theo nồng độ và thời gian quy định. Các kháng nguyên virus/vi khuẩn sau bất hoạt được kiểm tra tính bất hoạt bằng cách nhân liên tiếp 2 lần trên môi trường nuôi cấy thích hợp. Nếu cả 2 lần liên tiếp đều không thấy sự nhân lên của virus, chứng tỏ kháng nguyên được bất hoạt hoàn toàn.
Với kháng nguyên LaSota và IB –H120 sau bất hoạt, được gây nhiễm liên tiếp 2 lần trên trứng gà có phôi 9 - 11 ngày tuổi. Kết quả kiểm tra hai loại virus sau bất hoạt được trình bày qua bảng 4.10.
Bảng 4.10. Kết quả kiểm tra virus sau bấthoạt trên phôi trứng
Chất bất hoạt Nồng độ bất hoạt
Thời gian bất hoạt
Kết quả kiểm tra VR sau vô hoạt ND (LaSota) (HA,
EID50) IB-H120 (EID50)
Lần 1 Lần 2 Lần 1 Lần 2
Formalin 0,2% 12 giờ Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính
BEI 0,1M 12 giờ Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính
β- probiolacton 0,1% 12 giờ Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính
Kết quả kiểm tra tính bất hoạt cho thấy, Formalin ở nồng độ 0,2%, BEI 0,1M và β-propiolacton 0,1% có khả năng bất hoạt hoàn toàn virus và ở các nồng độ này, các chất bất hoạt cũng không gây ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi gà.
Các kháng nguyên sau bất hoạt được kiểm tra đáp ứng miễn dịch trên gà 3 tuần tuổi, mỗi loại chất bất hoạt được coi là 1 lô thí nghiệm, 10 gà/lô thí nghiệm. Gà có hiệu giá kháng thể âm tính với hai loại virus sẽ được tiến hành thí nghiệm. Gà được theo dõi, chăm sóc giống nhau trong suốt quá trình thí nghiệm. Kết quả kiểm tra được trình bày tại bảng 4.11.
Bảng 4.11. Kết quả kiểm tra tính đáp ứng miễn dịch của virus sau vô hoạt trên gà thí nghiệmtại D21
Tên VR PP kiểm tra Chỉ tiêu Chất bất hoạt Lô ĐC
Formalin BEI Beta-
probiolacton ND (LaSota) HI Tỷ lệ HGKT > 4log2 100% 100% 100% 0 GMT 7,5 7,2 7,5 0
IB-H120 ELISA Tỷ lệ dương tính
(S/p≥0,2) 100% 90% 90% 0
Theo số liệu ở bảng 4.11 cho thấy, kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng virus Newcastle của 3 lô gà thí nghiệm được gây miễn dịch bởi virus ND (LaSota) bất hoạt bằng 3 chất bất hoạt đều cho hiệu giá kháng thể >4 log2. Tuy nhiên, ở lô gà thí nghiệm được gây miễn dịch bởi virus ND bất hoạt bằng BEI cho hiệu giá kháng thể trung bình thấp hơn (chỉ đạt 7,2). Trong 3 lô gà thí nghiệm được gây miễn dịch bởi virus IB bất hoạt, chỉ có virus IB được bất hoạt
bằng formalin 0,2% cho đáp ứng miễn dịch tốt nhất, 100% gà có đáp ứng miễn dịch đối với virus IB.
Trên cơ sở kết quả kiểm tra virus sau bất hoạt trên phôi gà và đáp ứng miễn dịch trên gà thí nghiệm cho thấy Formalin là chất bất hoạt phù hợp với cả 02 loại kháng nguyên LaSota và IB-H120.
4.2.3. Kết quả xác định hàm lượng mỗi kháng nguyên có trong 1 liều vắc xin đơn vắc xin đơn
Để xác định hàm lượng kháng nguyên theo cơ số 10 có trong 01 liều vắc xin đơn, trong khuôn khổ đề tài tiến hành nghiên cứu 5 thang liều với từng loại kháng nguyên như sau:
Đối với kháng nguyên LaSota, từ 106 đến 1010 EID50/liều virus trước bất hoạt; Đối với kháng nguyên IBV, từ 103 đến 108 EID50/liều virus trước bất hoạt. Để có được kháng nguyên có hiệu giá cao hơn hiệu giá kháng nguyên kiểm tra được sẽ thực hiện biện pháp cô đặc kháng nguyên bằng máy siêu ly tâm.
Trên cơ sở lựa chọn được Formalin 0,2% sử dụng làm chất bất hoạt virus. Kết quả kiểm tra virus ND chủng LaSota bất hoạt được trình bày ở bảng 4.12.
Bảng 4.12. Kết quả kiểm tra virus ND (LaSota) ở 5 thang liều sau bất hoạt trên phôi trứng
Lô TN Hiệu giá KN
(EID50/liều)
Nồng độ chất bất hoạt
Thời gian bất hoạt
ND (LaSota) (HA, EID50)
Lần 1 Lần 2
TN1 106 Formalin 0,2% 12 giờ Âm tính Âm tính
TN2 107 Formalin 0,2% 12 giờ Âm tính Âm tính
TN3 108 Formalin 0,2% 12 giờ Âm tính Âm tính
TN4 109 Formalin 0,2% 12 giờ Âm tính Âm tính
TN5 1010 Formalin 0,2% 12 giờ Âm tính Âm tính
Kết quả bảng 4.12 cho thấy virus ND chủng LaSota tại các thang liều được sau 2 lần kiểm tra trên phôi trứng cho kết quả âm tính chứng tỏ bất hoạt hoàn toàn và không gây ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi gà.
Với virus IB tại 5 thang liều cũng được tiến hành kiểm tra virus sau bất hoạt trên trứng gà có phôi. Kết quả thực hiện cho thấy virus được bất hoat hoàn toàn trên trứng gà có phôi. Kết quả được trình bày ở bảng 4.13.
Bảng 4.13. Kết quả kiểm tra virus IB-H120 ở 5 thang liều sau bất hoạt trên phôi trứng
Lô TN Hiệu giá KN
(EID50/liều) Nbấồng đột hoạt chất
Thời gian
bất hoạt
IB-H120 (EID50)
Lần 1 Lần 2
TN1 103 Formalin 0,2% 12 giờ Âm tính Âm tính
TN2 104 Formalin 0,2% 12 giờ Âm tính Âm tính
TN3 105 Formalin 0,2% 12 giờ Âm tính Âm tính
TN4 106 Formalin 0,2% 12 giờ Âm tính Âm tính
TN5 107 Formalin 0,2% 12 giờ Âm tính Âm tính
Với mỗi loại vắc xin đơn tại từng thang liều, sau khi phối trộn với dầu Montanide ISA 71RVG theo tỷ lệ 60:40. Ở mỗi công thức đều được kiểm tra các chỉ tiêu về nhũ, độ nhớt, vô trùng. Kết quả được trình bày ở bảng 4.14.
Bảng 4.14. Kết quả kiểm tra vắc xin đơnở từng hiệu giá kháng nguyên sau phối trộnvới nhũ dầu
Loại VX Hiệu giá KN
(EID50/liều) trung bình Độ nhớt
Độ ổn định Vô trùng VX LaSota 106 40 mPa.s đạt đạt 107 40 mPa.s đạt đạt 108 41 mPa.s đạt đạt 109 41 mPa.s đạt đạt 1010 42 mPa.s đạt đạt VX IB- H120 103 41 mPa.s đạt đạt 104 41 mPa.s đạt đạt 105 42 mPa.s đạt đạt 106 42 mPa.s đạt đạt 107 42 mPa.s đạt đạt
Kết quả tại bảng 4.14 cho thấy độ nhớt trung bình của vắc xin nhũ dầu dao động từ 40-42 mPa.s. Tất cả các mẫu vắc xin đơn kiểm tra đều đạt độ ổn định và chỉ tiêu vô trùng.
Để đánh giá chất lượng vắc xin đơn toàn diện, vắc xin phải an toàn và sinh miễn dịch trên động vật thí nghiệm. Mỗi lô thí nghiệm để kiểm tra độ an toàn cho mỗi loại vắc xin đơn được thực hiện trên 10 gà thí nghiệm với liều gấp đôi liều khuyến cáo. Thời gian theo dõi thí nghiệm 21 ngày. Kết quả kiểm tra độ an toàn của từng vắc xin đơn được trình bày ở bảng 4.15.
Kết quả cho thấy toàn bộ gà thí nghiệm trong thời gian theo dõi đều sống khỏe mạnh bình thường, không có gà nào có biểu hiện của bệnh Newcastle và bệnh viêm phế quản truyền nhiễm. Vắc xin đều đạt chỉ tiêu an toàn trên động vật mẫn cảm.
Bảng 4.15. Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn từng vắc xin đơn tại 5 thang liều sau phối trộnvới chất bổ trợ dầu
Loại VX Hiệu giá KN (EID50/liều) Số gà TN (con) Liều sử dụng Thời gian theo dõi (ngày) Số gà sống Tỷ lệ sống VX LaSota nhũ dầu 106 10 2 liều/con 21 10 100% 107 10 2 liều/con 21 10 100% 108 10 2 liều/con 21 10 100% 109 10 2 liều/con 21 10 100% 1010 10 2 liều/con 21 10 100% VX IB nhũ dầu 10 3 10 2 liều/con 21 10 100% 104 10 2 liều/con 21 10 100% 105 10 2 liều/con 21 10 100% 106 10 2 liều/con 21 10 100% 107 10 2 liều/con 21 10 100% Lô đối chứng 10 Không dùng 21 10 100%
Vắc xin được đánh giá đáp ứng miễn dịch trên gà 3 tuần tuổi, mỗi công thức tương ứng với 1 lô thí nghiệm, mỗi lô thí nghiệm sử dụng 10 gà, theo dõi thu thập mẫu huyết thanh để kiểm tra hiệu giá kháng thể tại các thời điểm D7, D14, D21, D28.
Đánh giá đặc tính sinh miễn dịch của vắc xin Newcastle bằng việc đánh giá hiệu giá kháng thể kháng virus ND thông qua phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà (HI). Kết quả được trình bày qua bảng 4.16.
Bảng 4.16. Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng virus ND (LaSota) bằng phương pháp HI
Lô TN Hiệu giá KN
(EID50/liều) GMT trung bình tại các thời điểm lấy mẫu (logD0 D7 D14 D21 D28 2)
TN1 106 0 1.5 2.0 2.5 2.7
TN2 107 0 2.3 3.8 6.2 6.7
TN3 108 0 2.3 4.5 8.5 8.7
TN4 109 0 2.3 4.9 8.7 8.7
Qua bảng 4.16 cho thấy hiệu giá kháng thể bắt đầu xuất hiện ở ngày thứ 7 sau khi tiêm vắc xin, tuy nhiên hiệu giá kháng thể trung bình rất thấp, dao động từ 1,5-2,5 log2. Tại ngày thứ 14 sau khi tiêm vắc xin, hiệu giá kháng thể tăng dần ổn định tại ngày thứ 21 sau tiêm vắc xin. Hiệu giá kháng thể kháng virus ND trong 5 lô thí nghiệm tại cùng một thời điểm lấy mẫu xét nghiệm cho thấy ở hiệu giá kháng nguyên 106EID50/liều cho hiệu giá kháng thể trung bình thấp nhất. Hiệu giá kháng thể đạt mức cao và ổn định tại liều 108EID50/liều.
Đối với vắc xin IB, việc đánh giá đặc tính sinh miễn dịch bằng việc đánh giá hiệu giá kháng thể kháng virus ND thông qua phản ứng ELISA. Theo hướng dẫn sử dụng Kit ELISA của hàng IDEXX, mẫu huyết thanh có kết quả s/p > 0,2 được đánh giá dương tính. Kết quả trình bày tại bảng 4.17.
Bảng 4.17. Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể IBV bằng phương pháp Elisa
Lô TN
Nồng độ kháng
nguyên (EID50/liều)
% Dương tính tại các thời điểm lấy mẫu (%)
D0 D7 D14 D21 D28 TN1 103 0 0 10% 20% 30% TN2 104 0 0 10% 30% 30% TN3 105 0 0 30% 50% 60% TN4 106 0 0 50% 90% 90% TN5 107 0 10% 60% 90% 90%
Kết quả bảng 4.17 cho thấy ở ngày thứ 7 sau khi tiêm vắc xin, 4/5 lô thí nghiệm chưa xuất hiện kháng thể kháng virus IB. Ở nồng độ kháng nguyên 107EID50/liều, từ ngày thứ 7 đã có gà thí nghiệm sinh đáp ứng miễn dịch chống virus IB, tuy nhiên tỷ lệ rất thấp. Tại thời điểm 14 ngày sau khi tiêm vắc xin, gà ở tất cả các lô thí nghiệm đã có kháng thể kháng virus IB, theo tỷ lệ tăng dần từ nồng độ 103EID50/liều đến nồng độ 107EID50/liều. Hiệu giá kháng thể tăng và ổn định tại ngày thứ 21 sau tiêm vắc xin. Hiệu giá kháng thể đạt mức cao và ổn định tại nồng độ kháng nguyên 106EID50/liều và 107EID50/liều.
Để có thêm căn cứ kết luận hàm lượng kháng nguyên có trong một liều vắc xin đơn, tiến hành kiểm chứng lại để làm căn cứ xây dựng liều cơ sở cho phối trộn vắc xin nhị giá.
Vắc xin đơn sau khi phối trộn được kiểm tra đầy đủ các chỉ tiêu hóa lý, vô trùng. Đối với chỉ tiêu hóa lý vắc xin vô hoạt, tiến hành kiểm tra đánh giá cảm
quan vắc xin phải có màu trắng ngà, đồng nhất, không phân lớp. Các chỉ tiêu độ nhớt, độ ổn định được thực hiện theo phương pháp thường quy. Kết quả trình bày tại bảng 4.18.
Bảng 4.18. Kết quả kiểm tra vắc xin đơn sau phối trộnvới chất bổ trợ dầu
Loại VX Số mẫu kiểm tra Độ nhớt
trung bình Độ ổn định Vô trùng
VX LaSota 05 mẫu 40 mPa.s 5/5 mẫu đạt 5/5 mẫu đạt
VX IB-H120 05 mẫu 42 mPa.s 5/5 mẫu đạt 5/5 mẫu đạt
Kết quả tại bảng 4.18 cho thấy độ nhớt trung bình của vắc xin nhũ dầu dao động từ 40-42 mPa.s. Tất cả các mẫu vắc xin đơn kiểm tra đều đạt độ ổn định và