Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.11. Phương pháp xác định hiệu giá kháng thể kháng virus ND trong huyết
huyết thanh gà sau khi sử dụng vắc xin bằng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà HI (haemagglutination inhibition)
-Dùng đĩa nhựa 96 giếng, đáy chữ V hoặc U;
-Cho 50 µl nước muối sinh lý NaCl 0.9/5/PBS vào mỗi giếng từ giếng 1 đến giếng 12;
-Cho 50 µl huyết thanh cần kiểm tra vào giếng 1;
- Pha loãng huyết thanh theo cơ số 2: Trộn đều huyết thanh ở giếng 1, rồi hút 50 µl chuyển sang giếng 2 trộn đều, hút 50 µl chuyển sang giếng 3 tiếp tục làm như vậy đến giếng 11, hút bỏ 50 µl đi ở giếng 11;
-Cho kháng nguyên 4 đơn vị HA vào các giếng từ số 1 đến số 11, mỗi giếng 50 µl;
-Giếng 12 cho thêm 50 µl PBS;
-Lắc nhẹ, để nhiệt độ phòng 30 phút đến 1 giờ; -Cho vào mỗi giếng 50 µl hồng cầu 0.5-1%, lắc nhẹ;
-Để đĩa phản ứng ở nhiệt độ phòng. Sau 25-30 phút đọc kết quả.
Bảng 3.5. Sơ đồ thực hiện phản ứng HI (haemagglutination inhibition)
Nguyên liệu Giếng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 (đối chứng) NaCl 0.9%/PBS (µl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
Huyết thanh 50 Trộn đều, chuyển 50 từ giếng 1 đến 11 rồi hút bỏ 50 µl 0 KN 4 HA (µl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 0 Lắc đều, để 30 phút ở nhiệt độ phòng Hồng cầu (µl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 Độ pha loãng HT 2 1 4 1 8 1 16 1 32 1 64 1 128 1 256 1 512 1 1024 1 2048 1 - Cách đọc kết quả:
+ Phản ứng dương tính: Hồng cầu lắng xuống đáy, chứng tỏ kháng nguyên và kháng thể tương ứng.
+ Hiệu giá kháng thể được tính ở độ pha loãng cao nhất còn có hiện tượng ức chế ngưng kết hoàn toàn.
+ Phản ứng âm tính: Có hạt ngưng kết lấm tấm. Chứng tỏ không có sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể trong phản ứng.
+ Mẫu là huyết thanh có hiệu giá kháng thể lớn hơn hoặc bằng 1/16 (4 log2) thì mẫu đó được coi là dương tính và nhỏ hơn 1/16 (4 log2) là âm tính.
- Lưu ý:
+ Gà lấy máu là gà trống đã trưởng thành, khỏe mạnh, âm tính kháng thể Newcastle được nuôi ở khu chuồng an toàn dịch bệnh, dùng để lấy máu thường xuyên. Trước khi lấy máu cho gà ăn uống đầy đủ trước 1 giờ.
+ Trước khi thực hiện phản ứng HI, tiến hành kiểm tra hiệu giá virus bằng phản ứng HA, tiếp đến pha kháng nguyên 4HA và kiểm tra lại. Các bước thực hiện tương tự như các bước thực hiện phản ứng HA. Nếu kết quả ngưng kết đến giếng thứ 3, như vậy kháng nguyên pha đạt. Nếu ngưng kết đến giếng thứ 4 (hoặc hơn) là kháng nguyên pha đặc, khi đó thêm lượng PBS bằng lượng PBS ban đầu pha 4HA. Nếu ngưng kết chỉ giếng thứ 2 kháng nguyên pha loãng, khi đó thêm lượng kháng nguyên bằng lượng kháng nguyên ban đầu pha 4HA.