Trộn đều mẫu, nghiền qua mắt sàng 1mm. Cân khoảng 1 g mẫu. Thêm 8 mL acetonitril và 1mL Ethylacetate. Làm đồng đều hỗn hợp trong 3 phút. Ly tâm 5 phút với tốc độ 4000 rpm và lấy 6 mL dung dich lớp trên vào ống nghiệm. Thêm 1 mL n- hexan và 1 mL PBS. Làm đồng đều hỗn hợp trong 1 phút. Ly tâm 5 phút với tốc độ 4000 rpm và lấy 50 µL phần dung dịch lớp dưới đem phân tích trên ELISA ở bước sóng 450 nm.
26
* Phương pháp xét nghiệm miễn dịch cạnh tranh
Xét nghiệm miễn dịch dạng dòng sử dụng nano vàng gắn kháng thể được phát triển để xác định nhanh CLB [47]. Tác giả đã phát triển một thanh thử dựa vào nguyên lý xét nghiệm miễn dịch cạnh tranh xác định các mẫu nước tiểu lợn ở các nồng độ 0,0; 0,1; 0,3; 0,9; 2,7; 8,1 ng/mL. Giới hạn xác định của thanh thử nhanh thì thấp hơn 0,1 ng/mL. Giới hạn xác định bằng mắt thường 1,0 ng/mL. Thí nghiệm này cho kết quả sau 10 phút. Zhang Hong-Cai (2012) cũng sử dụng một sensor quang điện dựa trên xét nghiệm miễn dịch sử dụng hạt keo nano vàng để xác định nhanh CLB trong nước tiểu của lợn. Phản ứng cạnh tranh xảy ra giữa CLB trong mẫu và CLB-BSA trên đường kiểm tra với kháng thể gắn nano vàng sẽ làm mất đi màu trên đường test line. Sensor điện quang xác định CLB tuyến tính trong khoảng từ 1,0-10 µg/L với giới hạn xác định 0,05 µg/L. Độ chuyển hóa 85,46- 96,05% trong mẫu nước tiểu [48]. C. Song (2013) sử dụng sensor huỳnh quang dạng xét nghiệm dòng bên sử dụng hạt nano silica. Cường độ huỳnh quang trên đường kiểm tra là cơ sở để định tính và định lượng CLB. Kết quả chứng minh rằng sensor sử dụng hạt nano silica có độ nhạy tốt hơn các thanh thử nhanh sử dụng nano vàng truyền thống. Giới hạn xác định bằng mắt thường của thanh thử là 0,1 ng/mL trong khi giới hạn xác định bằng đo quang là 0,037 ng/mL. Độ chuyển hóa đạt 89,3-97,7%, thời gian xét nghiệm dưới 8 phút [49].
* Phương pháp xét nghiệm dạng cảm biến sinh học:
Một hướng mới tiêm enzym miễn dịch quang hóa để phân tích CLB dựa trên các hạt GoldMag đã được mô tả bởi Zhefei Li và cộng sự năm 2007 [50]. Theo tài
liệu này thì hạt GoldMag là một loại mới của hạt siêu thuận từ Fe3O4/Au sử dụng
như một chất mang trong hệ thống tiêm hóa chất phát quang. CLB kết hợp với avalbumin đã được cố định trên các hạt GoldMag và các hạt cố định trong một rãnh nhỏ bởi một điện từ bên ngoài. Khi hóa chất phát quang được tiêm vào trong các rãnh, ánh sáng phát ra từ bề mặt hạt từ được đo và ghi lại bằng cách sử dụng một thiết bị quang học. Phạm vi tuyến tính của phương pháp mới này là 0,01-0,1 ng/g và CLB phục hồi được 85-105%.
Chen Cunshe năm 2007 đã sử dụng protein F0F1-ATPase như một cảm biến sinh học để xác định dư lượng chất tăng trọng CLB trong thức ăn [51]. Protein F0F1-ATPase đóng vai trò là một chất enzym chìa khóa trong hệ thống sinh học. F0F1-ATPase là một hệ phức gồm hai phần, F0 và F1, kết cấu cơ học bởi một thân trung tâm phổ biến. Một đầu dò huỳnh quang F1300 đã được đánh dấu bên trong sắc tố bào, được sử dụng như một chỉ số pH trong quá trình phát hiện thông lượng
27
proton do ATP tổng hợp trong protein F0F1-ATPase. Hơn nữa, tiểu đơn vị F1β của protein F0F1-ATPase được giữ chặt bởi một hệ thống của anti-β-antibody-biotin- avidin-biotin-antibody thứ hai (dành riêng cho CLB) như một cảm biến để phát hiện dư lượng CLB. Cơ chế dựa trên sự phản ứng của antibody-antigen, trong đó cơ chế phát hiện phụ thuộc vào sự thay đổi huỳnh quang dựa trên sự thay đổi pH trong suốt quá trình tổng hợp ATP. Kết quả cho thấy rằng sự hoạt động của protein F0F1- ATPase bị ảnh hưởng bởi sự nạp niệu khác nhau và cảm ứng mới có thể chứng minh là một thiết bị nano hữu ích cho phát hiện siêu nhạy. Giới hạn phát hiện của
CLB là 10-12 g/l [51].
Traynor năm 2003 chỉ ra một phương pháp mới nhằm phát hiện các hợp chất β-agonist trong gan [52]. Phương pháp có khả năng phân tích được 16 mẫu gan trong 1,5 ngày. Dịch chiết được pha trộn với các kháng thể trước khi được tiêm 2 phút lên trên một cảm biến bọc CLB. Bề mặt cảm biến đã được tái tạo bằng NaOH 0,1 M. Thời gian phân tích của thí nghiệm này là 10 phút. Các thí nghiệm đã có thể phát hiện mabuterol dưới 0,02 ng/g, CLB là 0,11 ng/g và sal là 0,19 ng/g. Một miền rộng của các β-agonist khác được phát hiện tại nồng độ dưới 1,5 ng/g.
Ưu điểm:
- Thời gian phân tích nhanh.
- Thiết bị, dụng cụ, thao tác đơn giản, dễ sử dụng.
Nhược điểm:
- Tính chính xác của kết quả phân tích còn phụ thuộc vào kĩ năng, thiết bị thí nghiệm và thành phần của mẫu thí nghiệm.
- Dễ gây ra kết quả dương tính ảo do vậy phương pháp chỉ được áp dụng để sàng lọc.
Sử dụng chấm lượng tử chế tạo sensor huỳnh quang phát hiện một số chất cấm đang là hướng nghiên cứu được đặc biệt quan tâm. Do phương pháp này có thể áp dụng với các chất có khả năng hấp thụ hoặc phát xạ ánh sáng, phương pháp có thao tác đơn giản, chi phí đầu tư thấp mà vẫn cho kết quản đáng tin cậy do đó hứa hẹn có thể phát triển và áp dụng rộng rãi.
1.2. Chấm lƣợng tử
Chấm lượng tử (Qds) là những tinh thể nano bán dẫn có kích thước nhỏ hơn bán kính Bohr, là những hệ không chiều có thể giam giữ được điện tử, tạo ra các mức năng lượng gián đoạn như trong nguyên tử. Những tinh thể nano bán dẫn được cấu tạo từ các cặp nguyên tố thuộc những cặp phân nhóm như: II-VI, III-V, IV-VI,
28
mỗi chấm lượng tử có thể chứa từ 100-1000 nguyên tử (Hình 1.8), chẳng hạn như các chấm lượng tử CdS, CdSe, ZnS, ZnSe [53, 54]…