Mẫu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
CLB (g/mL) 0 10-12 10-11 10-10 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 10-4
Sau khi tiến hành các bước tạo liên kết chìa khóa tiến hành đo độ giảm cường độ quang của từng mẫu với từng sensor khác nhau, cường độ phát xạ của sensor được xác định với hệ đơn vị CPS, đây là hệ đơn vị được dùng trong định lượng, hệ đơn vị a.u chủ yếu được dùng đối với phép đo định tính, nó phù hợp với việc mô tả hình dạng phổ. Tiến hành xác định khoảng nồng độ mà tại đó độ giảm cường độ phát quang của sensor phụ thuộc tuyến tính với sự thay đổi nồng độ CLB. Từ đó có những đánh giá về khả năng xác định CLB của sensor chế tạo.
3.4.1 Nghiên cứu khả năng xác định CLB của sensor huỳnh quang được chế tạo từ Qds CdTe có sử dụng hiệu ứng FRET. chế tạo từ Qds CdTe có sử dụng hiệu ứng FRET.
Tiến hành đo cường độ quang của các mẫu đã được chuẩn bị như bảng 3.1, kết quả thể hiện rõ độ giảm cường độ quang của mẫu với các nồng độ khác nhau như hình 3.29.
Sự thay đổi cường độ huỳnh quang của sensor tương ứng với nồng độ của CLB được thể hiện rất rõ nét. Cường độ huỳnh quang của nano sensor giảm dần
tương ứng với sự tăng dần của nồng độ CLB. Ở nồng độ của CLB là 10-13
g/mL, thì không có sự thay đổi đáng kể so với Qds ban đầu và cường độ bị dập tắt hoàn toàn
ở nồng độ 10-4 g/mL. Xây dựng đồ thị thể hiện sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ
83
Hình 3.29. Sự thay đổi cường độ huỳnh quang theo nồng độ CLB
Hình 3.30. Tương quan giữa nồng độ CLB (CCLB) với cường độ phát xạ của sensor với cường độ phát xạ của sensor
84
Xây dựng đường tuyến tính thể hiện mối quan hệ giữa độ giảm cường độ
quang và logarit của nồng độ CLB trong khoảng nồng độ CLB từ 10-7-10-12 g/mL
(hình 3.30), phương trình thể hiện sự phụ thuộc vào logarit nồng độ CLB của cường độ quang của sensor theo phương trình Y = 8.5051×X-25.581.
3.4.2. Nghiên cứu khả năng xác định CLB của sensor huỳnh quang được chế tạo từ Qds CdS có sử dụng hiệu ứng FRET chế tạo từ Qds CdS có sử dụng hiệu ứng FRET
Tiến hành đo cường độ quang của các mẫu đã được chuẩn bị như bảng 3.1, kết quả thể hiện rõ độ giảm cường độ quang của mẫu với các nồng độ khác nhau như hình 3.31.
Hình 3.31. Phổ phát xạ của mẫu sensor với CLB ở các nồng độ khác nhau
Sự thay đổi cường độ huỳnh quang của sensor tương ứng với nồng độ của CLB được thể hiện rất rõ nét. Cường độ huỳnh quang của sensor giảm dần tương ứng với sự
tăng dần của nồng độ CLB. Ở nồng độ của CLB 10-12
g/mL, thì không có sự thay đổi
đáng kể so với Qds ban đầu và cường độ bị dập tắt hoàn toàn ở nồng độ 10-4
g/mL. Xây dựng đồ thị thể hiện sự phụ thuộc tuyến tính vào logarit nồng độ CLB của cường độ phát quang, như hình 3.32.
Đường tuyến tính thể hiện sự phụ thuộc của cường độ quang vào logarit
nồng độ CLB, trong khoảng nồng độ 10-12 g/mL đến 10-4 g/mL ta được phương
85
Hình 3.32. Đường tuyến tính giữa cường độ phát quang của mẫu sensor phụ thuộc vào log (CCLB, g/mL)
3.4.3. Nghiên cứu khả năng xác định CLB của sensor huỳnh quang được chế tạo từ GQds có sử dụng hiệu ứng FRET chế tạo từ GQds có sử dụng hiệu ứng FRET
Tiến hành đo cường độ quang của các mẫu chuẩn đã được chuẩn bị như bảng 3.1, kết quả đo được thể hiện như hình 3.33.
86
Nhận thấy cường độ phổ huỳnh quang của GQds trong sensor giảm khi tăng
nồng độ CLB và bị dập tắt hoàn toàn ở nồng độ CLB 10-4 g/mL. Tại nồng độ CLB
10-11 g/mL hình dạng phổ huỳnh quang của sensor gần giống với phổ huỳnh quang
của GQds.
Hình 3.34. Mối quan hệ giữa cường độ phát quang của GQds với logarit nồng độ CLB
Xây dựng phương trình thể hiện sự phụ thuộc giữa cường độ quang và
logarit nồng độ CLB, trong khoảng nồng độ CLB từ 10-4
-10-10 g/mL, thu được
phương trình Y = 206276,7×X – 758909,6.
Bảng 3.3. So sánh khả năng phát hiện CLB của các sensor huỳnh quang chế tạo từ các Qds khác nhau Sensor chế tạo từ Qds Khoảng nồng độ CLB (g/mL)
Phương trình cường độ quang
phụ thuộc log (CCLB, g/mL) Hệ số tương quan R2 CdTe 10-7-10-12 Y = 8,5051×X - 25,581 0,9638 CdS 10-4-10-12 Y = 480986,6×X – 1896690 0,9828 GQds 10-4-10-10 Y = 206276,7×X – 758909,6 0,9810
Như vậy sensor huỳnh quang được chế tạo từ các Qds CdTe, CdS và GQds có khả năng ứng dụng để xác định CLB (Bảng 3.3). Từ các kết quả thu được, nhận
87
thấy sensor huỳnh quang được chế tạo từ QDs CdS có khả năng vượt trội hơn hẳn trong việc xác định CLB, do vậy sensor huỳnh quang được chế tạo từ Qds CdS được sử dụng để xác định CLB trong các mẫu thực. Sensor huỳnh quang chế tạo
từ Qds CdS có khả năng phát hiện CLB trong khoảng nồng độ 10-12-10-4 g/mL và
phương trình thể hiện sự thay đổi cường độ quang phụ thuộc vào logarit nồng độ
là Y = 480986,6×X – 1896690, R2 = 0,9828.
3.5. Nghiên cứu khả năng xác định CLB của sensor huỳnh quang chế tạo từ Qds sử dụng hiệu ứng FRET trong mẫu thực từ Qds sử dụng hiệu ứng FRET trong mẫu thực
Để đánh giá khả năng xác định CLB trong mẫu thực bằng sensor huỳnh quang được chế tạo từ Qds CdS. Mẫu sạch không chứa CLB được thêm vào các
nồng độ 1, 10 và 103 ng/mL, rồi xử lý theo các quy trình hiện hành đang được áp
dụng tại Viện chăn nuôi. Mẫu sau khi được xử lý sẽ được đo độ giảm cường độ quang của sensor, từ phương trình Y = 480986,6×X – 1896690 thể hiện mối quan hệ tuyến tính giữa độ giảm cường độ quang của Qds với logarit nồng độ của mẫu chuẩn ta có thể dễ dàng xác định hàm lượng CLB có trong mẫu, từ đó làm căn cứ đánh giá hiệu quả của sensor.
3.5.1. Đánh giá khả năng xác định CLB của sensor trong mẫu thịt lợn
Mẫu thịt lợn sau khi thêm CLB chuẩn và được xử lý theo quy trình. Hỗn hợp sensor và mẫu đã được xử lý được đo cường độ quang. Kết quả cường độ quang được thể hiện như hình 3.35.
Từ đồ thị ta có thể xác định được cường độ phát xạ của sensor với các mẫu thịt lợn ở các nồng độ khác nhau, sau khi xác định được cường độ phát xạ từ đó áp vào phương trình đường chuẩn: Y = 480986,6×X – 1896690 ta tính được nồng độ CLB và độ chính xác.
Kết quả đo cường độ phát xạ của Qds tại nồng độ 10 ng/mL, I = 1970442,2 (cps). Thay vào phương trình Y = 480986,6×X – 1896690.
Ta có
Nồng độ CLB tính theo đường chuẩn là [CLB] = 10-x = 10-8,03 g/mL
88
Hình 3.35. Phổ phát xạ của sensor khi có mẫu thịt lợn đã được thêm chuẩn với các nồng độ khác nhau
Tính tương tự cho các nồng độ còn lại ta được kết quả như ở bảng 3.4. Bảng 3.4. So sánh độ chính xác của mẫu thịt lợn ở các nồng độ khác nhau
Nồng độ CLB thêm vào (ng/mL) Cƣờng độ phát xạ Nồng độ tính theo đƣờng chuẩn (ng/mL) Độ chính xác (%) 1 2456238,7 0,89 89 10 1970442,2 9,33 93,3 103 1022898,7 850,00 85,0
Sử dụng sensor huỳnh quang được chế tạo từ Qds CdS để xác định CLB trong
mẫu thịt lợn cho độ chính xác hơn 85%, đối với khoảng nồng độ từ 1-103
ng/mL.
3.5.2. Đánh giá khả năng xác định CLB của sensor trong mẫu nội tạng lợn
Mẫu nội tạng lợn sau khi được thêm chuẩn, được xử lý theo quy trình. Hỗn hợp sensor và mẫu đã xử lý được cường độ phát xạ, kết quả như hình 3.36.
89
Hình 3.36. Phổ phát xạ của sensor khi có mẫu nội tạng lợn đã được thêm chuẩn với các nồng độ khác nhau
Từ đồ thị ta có thể xác định được cường độ phát xạ của sensor với các mẫu nội tạng lợn ở các nồng độ khác nhau, sau khi xác định được cường độ phát xạ từ đó áp vào phương trình đường chuẩn: Y = 480986,6×X – 1896690 ta tính được nồng độ CLB và độ chính xác. Kết quả thu được như bảng 3.5.
Bảng 3.5. So sánh độ chính xác của mẫu nội tạng lợn ở các nồng độ khác nhau
Mẫu Nồng độ CLB thêm vào (ng/mL) Cƣờng độ phát xạ Nồng độ CLB tính theo đƣờng chuẩn (ng/mL) Độ chính xác (%) S1 1 2456340 0,891 89,1 S2 10 1970437 9,140 91,4 S3 103 1013278 880,000 88,0
Sử dụng sensor huỳnh quang được chế tạo từ chấm lượng tử Qds CdS để xác định CLB trong mẫu nội tạng lợn cho độ chính xác hơn 88%, đối với khoảng nồng
độ từ 1-103 ng/mL
3.5.3. Đánh giá khả năng xác định CLB của sensor trong mẫu nước tiểu lợn
Mẫu nước tiểu lợn sau khi được thêm chuẩn, xử lý theo quy trình. Hỗn hợp sensor và mẫu đã xử lý được đo cường độ quang trên hệ thống máy quang phổ, kết quả như hình 3.37.
90
Hình 3.37. Phổ phát xạ của sensor khi có mẫu nước tiểu lợn đã được thêm chuẩn với các nồng độ khác nhau
Từ đồ thị ta có thể xác định được cường độ phát xạ của sensor với các mẫu nước tiểu lợn ở các nồng độ khác nhau, sau khi xác định được cường độ phát xạ từ đó áp vào phương trình đường chuẩn: Y = 480986,6×X – 1896690 ta tính được nồng độ CLB và độ chính xác. Kết quả thu được như bảng 3.6.
Bảng 3.6. So sánh độ chính xác của mẫu nước tiểu ở các nồng độ khác nhau
Mẫu Nồng độ CLB thêm vào (ng/mL) Cƣờng độ phát xạ Nồng độ CLB tính theo đƣờng chuẩn (ng/mL) Độ chính xác (%) S1 1 2454198,14 0,900 90,00 S2 10 1967601,12 9,245 92,45 S3 103 1008884,20 910,200 91,02
Sử dụng sensor huỳnh quang được chế tạo từ Qds CdS để xác định CLB trong
mẫu nội tạng lợn cho độ chính xác hơn 90%, đối với khoảng nồng độ từ 1-103 ng/mL
3.5.4. Đánh giá khả năng xác định CLB của sensor trong mẫu thức ăn chăn nuôi chăn nuôi
Mẫu thức ăn chăn nuôi sau khi được thêm chuẩn, xử lý theo quy trình. Hỗn hợp sensor và mẫu đã xử lý được đo cường độ quang trên hệ thống máy quang phổ, kết quả như hình 3.38.
91
Hình 3.38. Phổ phát xạ của sensor khi có mẫu thức ăn chăn nuôi đã được thêm chuẩn với các nồng độ khác nhau
Từ đồ thị ta có thể xác định được cường độ phát xạ của sensor với các mẫu nước tiểu lợn ở các nồng độ khác nhau, sau khi xác định được cường độ phát xạ từ đó áp vào phương trình đường chuẩn: Y = 480986,6×X – 1896690 ta tính được nồng độ CLB và độ chính xác. Kết quả thu được như bảng 3.7.
Bảng 3.7. So sánh độ chính xác của mẫu thức ăn ở các nồng độ khác nhau
STT Nồng độ CLB thêm vào (ng/mL) Cƣờng độ phát xạ Nồng độ tính theo đƣờng chuẩn (ng/mL) Độ chính xác (%) S1 1,0 2458489 0,8817 88,17 S2 10 2016276,8 9,23 92,3 S3 103 1127626 860 86
Sử dụng sensor huỳnh quang được chế tạo từ chấm lượng tử Qds CdS để xác định CLB trong mẫu thức ăn chăn nuôi cho độ chính xác hơn 86%, đối với khoảng
nồng độ từ 1-103
92
3.6. So sánh khả năng xác định CLB của sensor huỳnh quang chế tạo từ Qds sử dụng hiệu ứng FRET với phƣơng pháp ELISA và HPLC/MS
Để đánh giá khả năng xác định CLB bằng phương pháp sử dụng sensor huỳnh quang chế tạo từ Qds CdS với phương pháp ELISA và HPLC/MS. Mẫu sạch
không chứa CLB được thêm vào các nồng độ 1, 10 và 103 ng/mL, rồi xử lý theo các
quy trình hiện hành đang được áp dụng tại Viện chăn nuôi, sau đó chia thành ba phần để tiến hành xác định CLB bằng ba phương pháp trên. Từ kết quả thu được và căn cứ vào lượng chất chuẩn ban đầu cho vào mẫu tiến hành đánh giá hiệu xuất thu hồi và đánh giá độ chính xác của phương pháp từ đó có những kết luật so sánh giữa các phương pháp.
3.6.1 So sánh khả năng xác định CLB bằng phương pháp huỳnh quang sử dụng sensor được chế tạo từ Qds sử dụng hiệu ứng FRET với phương sử dụng sensor được chế tạo từ Qds sử dụng hiệu ứng FRET với phương pháp ELISA
Bảng 3.8. Đặc điểm của bộ kít ELISA của Tecna-Ý dùng xác định CLB
Mẫu thực LOD (ppb)
Nước tiểu, mắt, tóc 0,185
Gan 0,296
Thịt 0,092
Thức ăn gia súc, bột sữa 3,700
Nước tiểu (phương pháp 2) 0,037
Gan (Phương pháp 2) 0,074
Một phần mẫu thức ăn chăn nuôi đã thêm chuẩn được phân tích sử dụng bộ kit ELISA CLENBUTEROL (Hãng sản xuất: Tecna – Ý, Xuất xứ: EU), đây là một bộ thuốc thử cho xét nghiệm miễn dịch phân tích định lượng dư lượng CLB trong mắt, tóc, gan, thịt, sữa, thức ăn chăn nuôi ... được sử dụng trong phòng kiểm nghiệm (Bảng 3.8).
Cùng mẫu thức ăn chăn nuôi ở trên sau khi tiến hành phân tích theo hướng dẫn sử dụng, kết quả xác định CLB thu được như bảng 3.9.
93
Bảng 3.9. Độ chính xác của mẫu thức ăn ở các nồng độ khác nhau theo phương pháp ELISA
Mẫu Nồng độ CLB thêm vào (ng/mL) Nồng độ CLB xác định đƣợc (ng/mL) Độ chính xác (%) S1 1 0,366 36,6 S2 10 6,510 65,1 S3 103 712,000 71,2
Từ bảng 3.6 và bảng 3.8, rút ra được bảng so sánh kết quả theo hai phương pháp khác nhau thu được kết quả như bảng 3.10.
Bảng 3.10. So sánh độ chính xác của phương pháp sensor và phương pháp ELISA khi xác định dư lượng CLB trong mẫu thức ăn chăn nuôi
Mẫu Nồng độ CLB thêm vào (ng/mL) Độ chính xác của phƣơng pháp sensor (%) Độ chính xác của phƣơng pháp ELISA (%) S1 1 88,17 36,6 S2 10 92,30 65,1 S3 103 86,00 71,2
Độ chính xác của phương pháp sensor xác định dư lượng CLB trong thức ăn chăn nuôi dựa vào hiệu ứng FRET quang cao hơn rất nhiều so với phương pháp ELISA, cách thức thực hiện đơn giản và thời gian thực hiện nhanh hơn.
3.6.2 So sánh khả năng xác định CLB bằng phương pháp huỳnh quang sử dụng sensor được chế tạo từ Qds sử dụng hiệu ứng FRET với phương pháp sử dụng sensor được chế tạo từ Qds sử dụng hiệu ứng FRET với phương pháp HPLC/MS
Tại phòng thí nghiệm của Viện Khoa học và Công nghệ - Bộ Công an. Mẫu thức ăn chăn nuôi có chứa CLB thêm chuẩn được phân tích trên hệ thống
HPLC/MS-Varian. Mẫu được chiết tách bằng dung dịch đệm K2HPO4, làm
sạch mẫu qua cột pha rắn SCX. Chế độ phân tích với cột C18 kích thước 2,1x100 mm, kích thước hạt nhồi 1,7 µm, cột được hoạt hoát bằng MeOH, thành
phần pha động MeOH/H2O, tốc độ pha động 300 µl/phút. Phổ sắc ký đồ của
94
Hình 3.39. Phổ sắc ký của CLB
Tiến hành phân tích phổ phân mảnh lần thứ nhất của CLB nhằm xác định ion sơ cấp, phổ khối của CLB khi tiến hành phân mảnh lần thứ nhất như hình 3.40.
95
Từ phổ khối của CLB sau khi tiến hành phân mảnh lần thứ nhất có thể dễ dàng nhận thấy, ion 277 có tỉ lệ là lớn nhất, do đó ion này được xác định là ion sơ cấp chính. Để quá trình định lượng CLB được chính xác hơn với độ chọn lọc cao hơn, ion này sẽ được sử dụng để tiếp tục phân mảnh xác định ion thứ cấp với các điều kiện khối phổ thích hợp, Phổ khối khi tiến hành phân mảnh ion sơ cấp như hình 3.41.
Hình 3.41. Phổ khối chuẩn của CLB khi tiến hành phân mảnh ion sơ cấp