Phương pháp điện hoá hoạt động dựa trên nguyên tắc, sự biến thiên cường độ dòng điện qua điện cực chỉ thị phụ thuộc sự thay đổi nồng độ của chất mẫu phân tích trong pha động chảy qua tế bào dòng chảy. Nguyên nhân sinh ra dòng điện này là do phản ứng điện hoá của chất phân tích xảy ra trên bề mặt điện cực chỉ thị khi nó được áp một điện thế không đổi phù hợp cho chất phân tích, chất phân tích hoặc bị
khử hoặc bị ôxy hoá. Dòng điện sinh ra ở đây là rất nhỏ (trong vùng nA - A), dòng
điện này được phát hiện nhờ một cặp điện cực đặt trong tế bào dòng chảy của sensor, trong đó có 1 cực chỉ thị và 1 cực so sánh. Điện cực so sánh thường dùng là cực calomen hay cực clorua bạc. Cực chỉ thị là cực rắn chế tạo bằng than thủy tinh (glassy carbon). Trong một số trường hợp cực chỉ thị còn được chế tạo từ hỗn hống Au-Ag. Nhưng để ổn định và khống chế, cũng như kiểm soát được quá trình đo ở cực chỉ thị trong tế bào dòng chảy của loại sensor này người ta còn lắp thêm một cực phụ trợ làm bằng kim loại trơ.
Với detector điện hoá loại này, pha động phải chứa chất điện ly trơ, như
NaCl, KCl, NH4Cl, LiCl.v.v. Chất điện ly trơ này cũng có thể được thêm vào từ
đầu của dung dịch pha động để dẫn qua cột tách HPLC, nếu nó có lợi cho sự tách, hoặc không ảnh hưởng đến sự tách. Còn ngược lại, nó phải được bơm vào pha động sau khi pha động ra khỏi cột tách, để trộn đều với chất phân tích trước khi dẫn vào tế bào dòng chảy để phát hiện chất phân tích. Trong trường hợp này, trước detector phải lắp thêm vòng phản ứng phụ để trộn đều chất điện ly vào pha động có chứa mẫu trước khi dẫn vào tế bào dòng chảy. Khi phản ứng ôxy hoá khử xảy ra trên bề mặt điện cực chỉ thị sẽ sinh ra dòng điện và dòng điện này là phụ thuộc vào nồng độ của chất phân tích có trong pha động chảy qua tế bào dòng chảy.
Phương pháp này cho độ nhạy tương đối cao (giới hạn phát hiện nằm trong vùng vài ng), nhưng có nhược điểm là tính chất bề mặt của cực chỉ thị có thể có ảnh hưởng lớn đến kết quả đo. Vì thế phải luôn luôn bảo vệ, kiểm tra và làm sạch bề mặt điện cực chỉ thị trước khi đo. Đồng thời trong quá trình đo còn xuất hiện sự sụt thế giữa hai cực. Để loại trừ yếu tố này người ta có thể dùng chất điện ly trơ có nồng độ cao và độ dẫn lớn.
22
* Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao - điện hóa
Phương pháp này được sử dụng lần đầu tiên để phát hiện CLB trên các mô võng mạc bò. Máy dò đã được thiết lập ở chế độ xung. Điện thế oxy hóa của một điện cực cacbon là 1,3 V và điện cực xung tham chiếu Ag/AgCl đã giảm xuống 2,0 V so với một điện cực tham chiếu Ag/AgCl chuẩn. Giới hạn phát hiện CLB theo phương pháp này là 5 ng/mL.
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với đầu dò điện hóa là một trong những phương pháp thay thế tốt được sử dụng trong những phòng thí nghiệm không có điều kiện sử dụng các thiết bị đắt tiền như GC-MS, LC-MS. v.v. Phương pháp này cho độ nhạy tốt và có nhiều chọn lọc hơn so với sensor UV-VIS. Brambill và cộng sự đã nghiên cứu CLB trong hoạt dịch có thể tồn tại trong các dung dịch HCl 1 M và NaCl 5 M do cơ chế trao đổi ion. Phương pháp này sử dụng dung dịch HCl 1 M làm môi trường tách. Axit ethylenediamin-tetraacetic (EDTA) được thêm vào sau khi tách nhằm xác định các ion cần thiết để đạt hiệu suất tách cao hơn [43].
* Phương pháp phân tích sử dụng cảm biến điện hóa phát quang
Đối với sensor huỳnh quang điện hóa (electrochemiluminescent, ECL), các tín hiệu được kích hoạt bởi các phản ứng điện hóa phát quang, có thể được sử dụng để tải nạp các chất ghi nhận xảy ra trên các điện cực. Do khả năng kiểm soát không gian và thời gian thuận lợi và độ nhạy cao, ECL được coi là sensor thích hợp cho sự nhận biết CLB ở mức độ rất thấp.
Yana [41] cùng các cộng sự đã chế tạo sensor điện hóa ECL để nhận biết CLB sử dụng Qds như đầu dò của ECL và hạt nano vàng (GNPs) như chất nền và là chất vận chuyển điện tử. ECL được chế tạo như mô tả hình 1.6, các hạt nano vàng (GNPs) được phủ lên trên bề mặt điện cực GCE đường kính 3 mm, sau đó các hạt GNPs được liên kết với các kháng nguyên CLB – OVA (clenbuterol-ovalbumin). Tiếp theo, phủ dung dịch huyết thanh bò (BSA), lớp CLB – BSA sử dụng như miễn dịch kháng nguyên. Cuối cùng, để thiết lập xét nghiệm miễn dịch cạnh tranh thì các sensor được nhúng vào hỗn hợp dung dịch CLB-antibody-Qds và CLB ở các nồng
độ khác nhau và sau đó được ủ ở 37o
C trong 1 h để CLB trong dung dịch cạnh tranh với các kháng nguyên phủ cố định để phản ứng với các tâm của kháng thể Qds để tạo thành miễn dịch phức tạp. Sau đó cường độ ECL của sensor được quét dưới dòng điện xoay chiều từ 0–1,7 V trong hỗn hợp dung dịch đệm photphat (PBS, pH = 7,4)
23
Hình 1.6. Quá trình chế tạo và cơ chế nhận biết của sensor ECL [41]
Dưới các điều kiện tối ưu, tín hiệu ECL phụ thuộc tuyến tính vào logarit nồng độ CLB trong phạm vi từ 0,02-50 ng/mL, và giới hạn phát hiện là 0,0084 ng/mL.
Zongyun Li (2012) [44] đã chế tạo sensor điện hóa để xác định lượng vết CLB trong nước tiểu lợn. Trong sensor điện hóa này, các hạt nano vàng sẽ được pha trộn với màng mỏng tritosan đã được cố định các kháng nguyên và kháng thể dán
nhãn Ru(bpy)32+ được sử dụng như các kháng thể đánh dấu. Phương pháp này cho
khoảng tuyến tính từ 0,010-1,0 ng/mL và giới hạn phát hiện CLB là 0,0050 ng/mL. Can Wu (2012) [45] cũng nghiên cứu chế tạo sensor điện hóa phát hiện CLB dựa trên hiệu ứng tăng cường của graphen oxit (GO). Một lượng lớn các nhóm chứa oxi đã được gắn lên trên bề mặt của GO giúp nâng cao hoạt tính điện hóa của GO. Sensor có giới hạn phát hiện CLB là 15 ng/mL và độ chính xác trong phạm vi từ 90,1-98,6%.
* Ưu điểm của phương pháp điện hóa:
- Hệ thống phân tích sử dụng phương pháp điện hóa có giới hạn phát hiện tương đối thấp.
- Chi phí đầu tư ban đầu ít tốn hơn so với hệ thống khối phổ. - Dễ triển khai tại hiện trường.
* Nhược điểm của phương pháp điện hóa:
- Bề mặt của điện cực chỉ thị dễ bị ngộ độc bởi các chất hoạt động bề mặt. - Điện cực đo cần được làm sạch sau mỗi lần đo, do vậy kết quả có độ lặp lại khó ổn định và chịu ảnh hưởng lớn của điều kiện đo này.
24