Các loại sensor
sensor vật lý sensor hóa học sensor sinh học
Khối lượng, áp suất, lực, sự di chuyển
Thành phần hóa học, nồng độ
Tương tác kháng nguyên/kháng thể, tương tác DNA, tương tác enzym
1.3.3.1. Ứng dụng hiệu ứng FRET và chấm lượng tử chế tạo sensor huỳnh quang xác định hàm lượng maltozơ quang xác định hàm lượng maltozơ
Mauro đã sử dụng Qds để chế tạo sensor theo hiệu ứng FRET bằng công nghệ tự lắp ghép phân tử. Sơ đồ cơ chế hoạt động của sensor này như hình 1.21.
Hình 1.21. Mô hình cơ chế hoạt động của sensor hiệu ứng FRET dùng Qds của Mauro [111]
Như mô hình trên, trên bề mặt của Qds phủ một lớp chất protein: Liên kế maltozơ-protein (Maltose- Binding Protein, MBP). Chất này có khả năng tạo chức năng hoạt hoá bề mặt Qds trong dung dịch đường. Sau đó cho thêm chất B- Cyclo.dextrin-Qsy9 với vai trò là chất dập tắt tín hiệu huỳnh quang (Quencher). Sensor này khi sử dụng để xác định hàm lượng mltozơ. Nếu trong môi trường có
46
chất maltozơ, tương tác giữa maltozơ với tác nhân Quencher, đẩy Quencher ra xa khỏi Qds. Kết quả theo hiệu ứng FRET, cường độ phát quang của Qds gia tăng. Lợi dụng kỹ thuật này, bằng việc sử dụng Qds, người ta có thể chế tạo sensor lai tạo (hybrid sensor).
1.3.3.2. Ứng dụng hiệu ứng FRET và Qds chế tạo sensor huỳnh quang xác định DNA định DNA
Cũng từ nguyên lý của hiệu ứng FRET, các nhà khoa học đang trong giai đoạn tạo ra loại sensor sinh học DNA nano bằng việc sử dụng Qds để xác định các DNA. Trong kỹ thuật này, các nhà phát minh đã sử dụng Qds là chất CdSe-ZnS được chế tạo bằng kỹ thuật lõi-vỏ làm chất cho. Trên bề mặt của Qds được biến tính hoạt hoá bằng chất streptavisin. Tiếp theo cho chất huỳnh quang Cy5.5 và biotin tác dụng với chất oligonucleotit tạo thành hai tác nhân hoạt hoá với vai trò khác nhau: tác nhân thông tin (reporter probe) và tác nhân liên kết (capture probe). Hai nhóm phân tử chức năng này liên kết với phân tử DNA cần xác định (mục đích DNA). Cụm phân tử hai chức năng thông tin và kết hợp có chứa DNA, liên kết với Qds đã biến tính (steptavidin conjugated Qds), tạo thành sensor sinh học DNA. Sensor sinh học DNA nano này có nhóm biotin kết hợp với chất steptavidin trên bề mặt Qds. Nhờ vậy hiệu ứng FRET được phát huy. Bằng phương pháp này, ta có thể kiểm chứng được DNA nhanh và độ chính xác cao. Hình 1.22 là mô hình cơ chế hoạt động của sensor sinh học DNA nano [108].
Hình 1.22. Mô hình và cơ chế hoạt động của sensor sinh học DNA nano Qds (a,b) và thiết bị kiểm tra (c) [103]
47
Nhìn chung, sensor sinh học nano hiệu ứng FRET dùng chất phát huỳnh quang Qds có nhiều ưu điểm so với huỳnh quang hữu cơ. Vì vậy có nhiều loại sensor sinh học để xác định ảnh in vivo được nghiên cứu chế tạo.
1.3.1.3. Ứng dụng hiệu ứng FRET và Qds chế tạo sensor huỳnh quang trong nghiên cứu enzym nghiên cứu enzym
Giáo sư Gae Baik Kim và Young-Pil Kim cùng các cộng sự tại đại học Hanyang Hàn quốc cũng nghiên cứu và phát triển phép phân tích enzym protease bằng nanosensor sử dụng Qds có hiệu ứng FRET [109]. Nghiên cứu này cho thấy việc phát hiện hoạt động của protease dựa trên sự truyền năng lượng của các Qds. Bằng cách kết hợp một số loại protease vào thiết kế của dạng Qds cho cấu trúc FRET và truyền năng lượng cộng hưởng phát quang sinh học (BRET), hoạt động của protease dẫn đến những thay đổi trong hiệu suất truyền năng lượng. Đặc biệt là do các đặc tính vượt trội của Qds, nó có thể được xem như một tác nhân nhận biết protease với độ nhạy cao. Người ta dự đoán rằng Qds dựa trên FRET/BRET như một đầu dò sẽ có một tiềm năng lớn trong việc phân tích vai trò cơ bản của protease và có khả năng chế tạo loại thuốc ức chế protease như thuốc điều trị sinh học dạng nano.
FRET là kỹ thuật phổ biến nhất được sử dụng trong các ứng dụng cảm biến sinh hóa hiện nay bởi độ nhạy cao, khả năng hồi phục trạng thái tốt, và khả năng quan sát trong thời gian thực. Phương pháp thông thường để phát hiện hoạt động protein được dựa trên phát huỳnh quang với các liên kết peptide hữu cơ. Ví dụ cho hoạt động protease là đầu dò tự động, đầu dò mang màu kép, và đầu dò dựa trên các photon hiệu ứng FRET, như mô tả trong hình 1.23. Tuy nhiên, việc phát huỳnh quang hữu cơ thường gặp một vài vấn đề chẳng hạn như hình ảnh bị tẩy trắng, độ nhạy ảnh hưởng bởi môi trường, khó khăn trong việc phân tích tổ hợp D và A. Như đã nói ở trên, những vấn đề này trong các nghiên cứu về FRET có thể được khắc phục khi có phổ huỳnh quang thích hợp hoặc dập tắt được sử dụng kết hợp với Qds (Hình 1.23). Từ Qds có dải hấp thụ rộng và phổ phát xạ hẹp cũng như sự ổn định quang cao, sẽ có thuận lợi trong việc theo dõi lâu dài và cho phép phát hiện, Qds thường được sử dụng như chất D trong khi các chất nhận năng lượng huỳnh quang (chất dập tắt) thường là một peptide được biến tính thích hợp.
48
Hình 1.23. Sơ đồ cảm biến FRET cơ bản để phát hiện các protease hoạt động. (A) Quá trình FRET thông thường, (B) FRET sử dụng Qds. D và A là chất cho và chất
nhận, tương ứng [109].
Nghiên cứu và ứng dụng hiệu ứng FRET trong lĩnh vực quang học đang là hướng đi mới, có nhiều triển vọng trong nhiều lĩnh vực bởi những tính chất đặc trưng của chúng.
Với những cơ sở khoa học đã nêu luận án có nhiệm vụ Thiết lập qui trình chế tạo sensor huỳnh quang từ chấm lượng tử CdTe, CdS và graphen sử dụng hiệu ứng FRET có khả năng nhận biết CLB, các nội dung thực nghiệm chính:
- Chế tạo sensor huỳnh quang sử dụng Qds bán dẫn.
- Nghiên cứu khả năng xác định CLB của sensor huỳnh quang được chế tạo từ Qds CdS, CdTe và graphen sử dụng hiệu ứng FRET.
- Nghiên cứu khả năng xác định CLB của sensor huỳnh quang chế tạo từ Qds sử dụng hiệu ứng FRET trong mẫu thực.
- Đánh giá khả năng xác định CLB của phương pháp sensor huỳnh quang chế tạo từ Qds sử dụng hiệu ứng FRET với phương pháp ELISA và HPLC/MS.
49
CHƢƠNG 2. THỰC NGHIỆM
2.1. Hóa chất
- Clenbuterol (CLB) (C12H18Cl2N2O) ((4-amino-[(tert-butylamino)methyl]-
3,5 dichlorobenzylalcoholhydrochloride), M = 313,65 g/mol, độ tinh khiết > 98%, được cung cấp bởi hãng Sigma Aldrich (USA).
- Qd CdTe nồng độ nồng độ 10-4 M được bọc bởi axit 3- mercaptopropionic
(bước sóng phát xạ 530 nm) do Viện Khoa học Vật liệu, Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam cung cấp.
- Qds CdS nồng độ 10-6 M được bọc bởi axit 3- mercaptopropionic (bước sóng
phát xạ 490 nm), do viện Khoa học Vật liệu, viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cung cấp;
- Các mẫu thức ăn chăn nuôi, mẫu nước tiểu, mẫu nội tạng vật nuôi và thịt
lợn đã xử lý từ phòng Phân tích thức ăn và sản phẩm chăn nuôi - Viện Chăn nuôi.
- N-(1-Naphthyl)ethylenediamine dihydrocloride (C12H14N2.2HCl); Axit L-
glutamic (C5H9O4), graphite nở (EG), NaOH, NaNO2, HCl được cung cấp bởi
Sigma Aldrich (USA);
2.2. Chế tạo sensor huỳnh quang dạng dung dịch xác định CLB dựa vào hiệu ứng FRET hiệu ứng FRET
2.2.1. Phản ứng diazo CLB
CLB trong cấu trúc phân tử có chứa hai nhóm amin, một ở mạch nhánh, một ở nhân benzen. Với nhóm amin ở nhân benzen ta có thể tiến hành phản ứng diazo
hóa trong môi trường NaNO2/HCl. Trong cấu tạo của sản phẩm chăn nuôi như thịt,
nội tạng, nước tiểu... có hợp chất amin trong protein, urea. Những hợp chất này không có khả năng tạo thành diazo. Hợp chất CLB sau khi đã được diazo hóa dễ tạo phản ứng cộng hợp với hợp chất NED hình thành chất mầu azo. Đây là nhóm chìa khóa trong sensor nhận biết CLB.
Cân 3 mg CLB và thêm vào đó 3 mL dung dịch HCl 0,01 M. Khuấy nhẹ
trong 10 phút ở 4oC. Tiếp đó, cân 1,38 mg NaNO2 cho vào một cốc thủy tinh khác
và hòa tan lượng NaNO2 đó với 2 mL nước cất để thu được dung dịch NaNO2
0,01 M, điều chỉnh nhiệt độ cốc về 4oC khoảng 10 phút trước khi cho phản ứng.
Hỗn hợp CLB và HCl khuấy sau 10 phút thì nhỏ từ từ 2 mL dung dịch NaNO2 đã
pha ở trên vào hỗn hợp đó và tiếp tục khuấy ở nhiệt độ 4oC trong 5 phút trong bóng
50
Hình 2.1. Phản ứng diazo hóa CLB [111]
2.2.2. Phản ứng cộng hợp của diazo CLB với napthyletylen diamin (NED)
CLB sau khi diazo đã có nhóm chìa khóa để có thể tạo liên kết một cách chọn lọc với NED trước khi liên kết với Qds. Phản ứng với diazo CLB với NED được tiến hành như sau. Sau khi thực hiện phản ứng diazo, tiếp tục nhỏ từ từ 1,2 mL dung dịch N-1- naphthylethylen diamin dihydrochlorid 0,01 M vào hỗn hợp DCL.
Tiếp tục khuấy hỗn hợp trong điều kiện nhiệt độ 4oC, không có ánh sáng, phản ứng
được mô tả như hình 2.2
Hình 2.2. Phản ứng cộng hợp giữa NED và DCL
Kết thúc phản ứng thu được dung dịch có màu đỏ, giữ ở 4oC trước khi sử
dụng. Để chứng minh thực tể có xảy ra phản ứng cộng NED với DCL, dung dịch màu đỏ sau phản ứng được sử dụng để đo phổ hấp thụ và phổ hồng ngoại để nghiên cứu cấu trúc của tổ hợp chất nhận (DCL-NED). Phản ứng cộng NED vào DCL phụ thuộc vào hai yếu tố chính là pH và tỉ lệ NED, trong nghiên cứu này do dư NED không ảnh hưởng tới kết quả nghiên cứu do vậy tôi đã tiến hành khảo sát và tìm điều kiện pH tối ưu tiến hành phản ứng.
2.2.3. Sensor huỳnh quang phát hiện CLB sử dụng Qds CdTe
Với mỗi dung dịch sensor, 1 µmol Qds CdTe và 10 mmol NED được cho
vào một lọ và khuấy nhẹ trong 30 phút ở nhiệt độ 25oC để cố định phân tử NED lên
trên bề mặt Qds. Qds CdTe tích điện âm do có nhóm COO-
71
Hình 3.14. So sánh phổ UV-Vis của CLB, DCL và NDCL
So sánh phổ hấp thụ của CLB, DCL và tổ hợp DCL-NED (Hình 3.14) nhận thấy, CLB có cực đại hấp thụ tại bước sóng 291 nm. Sau khi biến tính CLB bằng phản ứng diazo, hợp chất DCL có thêm một đỉnh hấp thụ tại bước sóng 345 nm và phân tử DCL-NED có phổ hấp thụ từ 400-550 nm, cực đại hấp thụ tại 464 nm đóng vai trò là chất nhận. kết hợp với các kết quả khảo sát tính chất quang của các Qds đã khảo sát có thể nhận thấy rằng, với khoảng hấp thụ của NED-DCL từ 400-550 nm, sẽ cho một phần trùng chập với phổ phát xạ của các Qds đây là điều kiện quan trọng xảy ra hiệu ứng FRET.
Như vậy bằng cách tiến hành phản ứng diazo hóa CLB sử dụng NaNO2, pH = 3,
phản ứng tiến hành trong điều kiện nhiệt độ thấp, rồi sau đó sử dụng NaOH điều chỉnh pH = 4 rồi tiến hành cộng hợp với lượng dư NED, tôi đã tạo thành công tổ hợp chất nhận với bước sóng hấp thụ cực đại tại 464 nm. Đây là bước quang trọng trong việc chế tạo sensor từ các Qds sử dụng hiệu ứng FRET xác định CLB.
3.2.3 Đánh giá khả năng liên kết của NED với Qds
Một trong những điều kiện quan trọng của việc ứng dụng hiệu ứng FRET trong phép phân tích quang học là khả năng tạo cầu nối giữa chất cho và tổ hợp chất nhận, đảm bảo duy trì khoảng cách giữa chúng từ 1-10 nm. Trong nghiên cứu này
72
NED một mặt có khả năng liên kết tĩnh điện với các Qds mặt khác có khả năng tạo liên kết chìa khóa với CLB đã được diazo hóa. Tôi đã tiến hành khảo sát khả năng tạo liên kết của NED với Qds bằng cách ủ dung dịch sensor Qds với NED, rồi sau đo tiến hành đo phổ phát xạ của sensor sau khi ủ. Nếu cường độ phát xạ cực đại không thay đổi điều đó cho thấy kích thước của Qds hay nói một cách khác không gian giam giữ lượng tử không tăng, chứng tỏ NED không tạo liên kết với sensor Qds. Nếu phổ phát xạ của sensor đã được ủ với NED có sự dịch chuyển cực đại hấp thụ về phía sóng dài, chứng tỏ NED đã tạo liên kết với sensor Qds. Phổ hấp thụ cũng như cực đại hấp thụ của dung dịch sensor dịch chuyển về phía sóng dài là do, khi NED liên kết với Qds làm bán kính giam giữ năng lượng lượng tử hóa tăng lên, điều này có nghĩa là năng lượng bị giảm đi trước khi phát xạ, do năng lượng giảm dẫn đến bước sóng phát xạ tăng lên.
3.2.3.1 Đánh giá khả năng tạo liên kết của NED với Qds CdTe
Sensor được chế tạo từ Qds CdTe sau khi liên kết với NED được xác cấu trúc hình thái học như hình 3.15.
Hình 3.15. Ảnh TEM của Qds CdTe (trái); CdTe-NED (phải)
Từ ảnh TEM (Hình 3.15) có thể nhận thấy sự tăng kích thước của sensor sau khi được biến tính bằng NED. Chứng tỏ sự hình thành liên kết giữa phân tử NED và Qds. Các liên kết này đảm bảo cho khoảng cách giữa chất cho và nhận huỳnh quang ở mức độ nhỏ nhất có thể để xảy ra hiệu ứng FRET trong sensor.
Phổ phát xạ của Sensor được chế tạo từ Qds CdTe trước khi thêm NED và sau khi được biến tính bởi NED như hình 3.16.
73
Hình 3.16. Phổ phát xạ của Qds CdTe và Qds CdTe sau khi gắn ligand NED
Dung dịch Qds CdTe ban đầu có bước sóng phát xạ là 530 nm, còn sau khi biến tính với NED thì bước sóng phát xạ đã dịch chuyển 7 nm về phía bước sóng dài (Hình 3.16), chứng tỏ các phân tử NED đã được gắn thành công trên bề mặt Qds là tăng kích thước hạt của Qds do đó bước sóng phát xạ tăng. Tuy có sự dịch chuyển nhẹ bước sóng phát xạ nhưng có thể khẳng định rằng NED không làm thay đổi cường độ phát xạ và tính chất quang của Qds ban đầu.
Phân tử NED có khả năng tạo liên kết với Qds CdTe, đây là một điều kiện quan trọng đảm bảo khoảng cách giữa chất cho và tổ hợp chất nhận trong hiệu ứng FRET.
3.2.3.2 Đánh giá khả năng tạo liên kết của NED với Qds CdS
Sensor được chế tạo từ Qds CdS sau khi liên kết với NED được xác cấu trúc hình thái học như hình 3.17.
74
Từ ảnh TEM (Hình 3.17) có thể nhận thấy sự tăng kích thước của sensor sau khi được biến tính bằng NED. Chứng tỏ sự hình thành liên kết giữa phân tử NED và Qds. Các liên kết này đảm bảo cho khoảng cách giữa chất cho và nhận huỳnh quang ở mức độ nhỏ nhất có thể để xảy ra hiệu ứng FRET trong sensor.
Dung dịch Qds CdS được đo phổ phát xạ trước khi thêm NED và sau khi được biến tính bởi NED (Hình 3.18).
Hình 3.18. Phổ phát xạ của Qds CdS và Qds CdS sau khi gắn ligand NED
Dung dịch Qds CdS ban đầu có bước sóng phát xạ là 490 nm, sau khi được biến tính với NED, bước sóng phát xạ đã dịch chuyển 6 nm về phía bước sóng dài, chứng tỏ các phân tử NED được gắn thành công trên bề mặt Qds là tăng kích thước hạt của Qds do đó bước sóng phát xạ tăng. Kết quả này phù hợp với kết quả ảnh TEM trên hình 3.18. Tuy có sự dịch chuyển nhẹ bước sóng phát xạ nhưng có thể khẳng định rằng NED không làm thay đổi cường độ phát xạ và tính chất quang của Qds ban đầu.
Phân tử NED có khả năng tạo liên kết với Qds CdS, đây là một điều kiện quan trọng đảm bảo khoảng cách giữa chất cho và tổ hợp chất nhận r trong hiệu ứng FRET.
3.2.3.3 Đánh giá khả năng tạo liên kết của NED với GQds
Sensor được chế tạo từ GQds sau khi liên kết với NED được xác định cấu trúc hình thái học như hình 3.19.